La coltura prevede la crescita del germe in un terreno nutritivo liquido o solido; l'aumento del numero di microrganismi semplifica l'identificazione. La coltura facilita anche le prove di sensibilità agli antibiotici.
La comunicazione con il laboratorio è fondamentale. Nonostante la maggior parte dei campioni venga seminata su terreni standard (p. es., agar sangue o cioccolato), alcuni patogeni richiedono l'addizione di nutrienti e inibitori specifici (vedi tabella Terreni selettivi per l'isolamento di batteri comuni) o di altre condizioni speciali per l'incubazione (p.es., temperatura specifica, concentrazione di acqua o di diossido di carbonio, o durata). Se si sospetta uno di questi patogeni più fastidiosi o se il paziente ha assunto antimicrobici, il laboratorio deve essere avvisato. Si segnala la fonte del campione in modo che il laboratorio possa differenziare i patogeni dalla normale flora specifica della sede in questione.
Terreni selettivi per l'isolamento di batteri comuni
Raccolta del campione
La raccolta del campione è importante. Per la diagnosi di malattie infettive, la regola generale è il campione in cui l'infezione è presente. Nelle lesioni devono essere campionati i bordi, non il centro.
L'uso di tamponi è sconsigliato. Tuttavia, se viene utilizzato un tampone, è preferibile utilizzare un tampone floccato perché può recuperare più campione. I tamponi utilizzati per le analisi molecolari devono essere compatibili con lo specifico saggio molecolare per cui sono destinati. Un tipo di tampone non adatto può produrre risultati falsi negativi. I tamponi con manico di legno sono tossici per alcuni virus. I tamponi con punta di cotone sono tossici per alcuni batteri, comprese le clamidie.
Le emocolture richiedono la decontaminazione e la disinfezione della cute (p. es., tampone di iodopovidone, fatto asciugare e rimosso con alcol al 70%). Sono generalmente utilizzati campioni multipli, ciascuno da un sito differente; sono presi quasi contemporaneamente, se possibile, durante i picchi febbrili. La normal-flora della cute che cresce soltanto in un singolo campione di sangue viene generalmente interpretata come contaminazione.
Se un campione di sangue viene prelevato da un catetere centrale, bisogna anche prelevare un campione di sangue periferico per poter meglio differenziare una batteriemia sistemica da un'infezione del catetere. Generalmente le colture da cateteri infetti si positivizzano più rapidamente e contengono più microrganismi rispetto alle colture del sangue periferico prelevato simultaneamente. Alcuni funghi, in particolare muffe (p. es., Aspergillus sps), in genere non possono essere coltivate dal sangue.
Il campione deve essere trasportato rapidamente, nel terreno corretto, e in condizioni che limitano la crescita della normale flora potenzialmente contaminante. Per un'accurata quantificazione del germe patogeno, bisogna impedire la crescita di patogeni addizionali; i campioni devono essere trasportati immediatamente in laboratorio o, se si ritarda il trasporto, refrigerati (nella maggior parte dei casi).
Considerazioni speciali per le colture
Alcune colture meritano considerazioni speciali.
I batteri anaerobi non devono essere coltivati dalle sedi in cui costituiscono parte della flora normale perché può essere impossibile differenziare i patogeni dalla flora normale. Bisogna evitare il contatto dei campioni con l'aria, e ciò può risultare difficile. Per i campioni su tampone, sono disponibili mezzi di trasporto anaerobi. Tuttavia, campioni di fluido (p. es., contenuti ascesso) sono migliori per tamponare campioni per il recupero di batteri anaerobi. I campioni di fluido devono essere raccolti con una siringa da cui è stata espulsa tutta l'aria (per minimizzare il contatto del campione con l'ossigeno) e inviati a un laboratorio nella siringa (chiusa senza ago) o trasferiti a una fiala per il trasporto anaerobico.
I micobatteri sono difficili da coltivare. I campioni contenenti la normal-flora (p. es., espettorato) devono essere prima decontaminati e concentrati. Il Mycobacterium tuberculosis e altri micobatteri crescono lentamente. La crescita di M. tuberculosis è in genere più veloce nel liquido che in mezzi solidi; l'uso di routine di sistemi automatizzati con liquidi può comportare la crescita entro 2 settimane versus ≥ 4 settimane su supporti solidi come Lowenstein-Jensen agar. Inoltre, in un campione possono essere presenti pochi microrganismi. Il campionamento multiplo dalla stessa sede può contribuire a massimizzare i risultati. I campioni devono continuare a crescere per 8 settimane prima di essere eliminati. Il M. ulcerans, che causa l'ulcera di Buruli, richiede fino a 12 settimane a 32° C su agar Lowenstein-Jensen. Qualora si sospetti un micobatterio atipico, il laboratorio deve essere informato del sospetto diagnostico.
I virus vengono generalmente coltivati da tamponi e campioni di tessuto spesso trasportati in mezzi contenenti sostanze antibatteriche e antifungine. I campioni vengono inoculati all'interno di colture tissutali che supportano il virus sospetto e inibiscono tutti gli altri microbi. I virus altamente labili (p. es., varicella zoster) vanno inoculati in coltura entro 1 h dalla raccolta. Le colture tissutali standard sono più sensibili. La tecnica di coltura rapida, in cui il campione viene centrifugato su un monostrato cellulare all'interno di una fiala, fornisce risultati più rapidi (2 giorni contro 7 a 14 giorni). Alcuni virus comuni non possono essere riconosciuti attraverso i metodi di coltura comuni e richiedono metodi alternativi per la diagnosi (vedi tabella Test diagnostici per virus frequenti che non crescono nelle colture virali di routine), come le seguenti:
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Test immunoenzimatico per l'Epstein-Barr virus, per i virus dell'epatite B, i virus dell'epatite E, per l'HIV, e per il virus T-linfotropico dell'uomo
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Test sierologici per i virus dell'epatite A e virus dell'epatite D
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Metodi basati sugli acidi nucleici per l'HIV
Test diagnostici per virus frequenti che non crescono nelle colture virali di routine
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Condizioni comuni |
Virus |
Test diagnostici |
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Malattia febbrile acuta, meningoencefalite |
Alfavirus, flavivirus, bunyavirus (p. es., virus dell'encefalite di St. Louis, virus La Crosse dell'encefalite) |
EIA (dosaggio immunoenzimatico), metodi basati sugli acidi-nucleici |
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Rotavirus, calicivirus (norovirus), astrovirus |
Metodi basati su acidi nucleici, microscopia immunoelettronica o microscopia elettronica |
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Virus di Epstein-Barr |
EIA (dosaggio immunoenzimatico), metodi basati sugli acidi-nucleici |
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Febbri emorragiche, coriomeningite linfocitaria |
Filovirus, arenavirus (p. es., febbre di Lassa, Ebola virus) |
Metodi basati su acidi nucleici, microscopia elettronica |
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Epatite |
Test sierologici, metodi basati sugli acidi nucleici |
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EIA (dosaggio immunoenzimatico), metodi basati sugli acidi nucleici |
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Epatite C, epatite G |
Metodi basati sugli acidi nucleici, EIA (dosaggio immunoenzimatico) |
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Rosolia, sarcoma di Kaposi, infezioni diffuse |
Herpes virus 6, 7, 8 |
Metodi basati sugli acidi nucleici, EIA (dosaggio immunoenzimatico) |
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AIDS |
Metodi basati sugli acidi nucleici, EIA (dosaggio immunoenzimatico), Western blot |
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Condilomi acuminati, cancro della cute genitale |
Metodi basati sugli acidi-nucleici, EIA (dosaggio immunoenzimatico) |
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Quinta malattia (eritema infettivo) |
Parvovirus umano B19 |
Metodi basati sugli acidi nucleici, EIA (dosaggio immunoenzimatico) |
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Leucemia a cellule T dell'adulto |
Virus T-linfotropico umano |
EIA (dosaggio immunoenzimatico), metodi basati sugli acidi nucleici |
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Leucoencefalopatia multifocale progressiva, infezione renale |
Polioma virus (JC e BK) |
Metodi basati sugli acidi nucleici |
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Vaiolo, vaiolo delle scimmie, virus del vaccino, mollusco contagioso |
Poxvirus |
Metodi basati sugli acidi nucleici, microscopia elettronica, metodi di coltura a seconda del virus |
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Virus della rabbia |
Microscopia elettronica, test in immunofluorescenza (IFA), metodi basati sugli acidi nucleici |
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Virus della rosolia |
Dosaggio immunoenzimatico, test in immunofluorescenza (IFA), metodi basati sugli acidi nucleici |
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EIA (enzyme immunoassay) = dosaggio immunoenzimatico; EM = electron microscopy; IEM = immunoelectron microscopy; IFA = immunofluorescence assay (test in immunofluorescenza). |
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I campioni di miceti ottenuti da siti non sterili devono essere inoculati in terreni che contengono sostanze antibatteriche. I campioni devono essere in grado di crescere per 3-4 settimane prima di essere eliminati.
