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Metodi di identificazione per le malattie infettive basati sugli acidi nucleici

Di

Maria T. Vazquez-Pertejo

, MD, FACP, Wellington Regional Medical Center

Ultima modifica dei contenuti giu 2020
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L'identificazione basata sugli acidi nucleici (molecolare) è diventata comune in ambito clinico; l'identificazione rapida risultante permette al paziente di essere posto in terapia antimicrobica specifica ed evitare una gestione prolungata empirica, farmaci potenzialmente inappropriati.

I metodi di identificazione basati sugli acidi nucleici identificano sequenze di DNA o RNA organismo-specifiche estratte dal microrganismo. Le sequenze possono essere o meno amplificate in vitro.

I metodi di identificazione basati sugli acidi nucleici sono generalmente specifici e altamente sensibili e possono essere utilizzati per tutte le categorie di microbi. I risultati possono essere forniti in maniera rapida. Poiché ciascun test è generalmente specifico per un singolo microrganismo, il medico deve conoscere le possibilità diagnostiche e richiedere i test di conseguenza. Per esempio, se un paziente ha sintomi indicativi dell'influenza ma la stagione influenzale è finita, è meglio fare un test diagnostico virale più generico (p. es., la coltura virale) piuttosto che un test specifico per l'influenza perché la causa della sintomatologia potrebbe essere un altro virus (p. es., parainfluenza, adenovirus).

I recenti progressi hanno portato allo sviluppo di saggi multiplex, in cui un singolo test basato sugli acidi nucleici è in grado di rilevare e differenziare tra ≥ 2 microrganismi. Saggi multiplex sono solitamente meno sensibili dei test qualitativi, a singolo bersaglio. Possono anche essere meno specifici; risultati positivi non anticipati, incoerenti con il quadro clinico del paziente, devono essere considerati con cautela. I saggi multiplex sono al momento impiegati per identificare agenti impiegati per la guerra biologica.

I test basati sugli acidi nucleici sono qualitativi, ma esistono metodi di quantificazione per un numero limitato ma crescente di infezioni (p. es., epatite B, epatite C, HIV, cytomegalovirus, virus linfotrofico umano a cellule T); questi metodi possono essere utili per la diagnosi e per monitorare la risposta al trattamento.

Test non amplificato

Le tecniche che hanno come target le sequenze di acidi nucleici, ma che non richiedono l'amplificazione delle sequenze sono solitamente ristrette a situazioni in cui il microrganismo è stato precedentemente messo in coltura o è presente ad alte concentrazioni nel campione (p. es., nella faringite da Streptococcus di gruppo A, nelle infezioni genitali da Chlamydia trachomatis o Neisseria gonorrhoeae).

Amplificazione degli acidi nucleici

Le tecniche di amplificazione degli acidi nucleici prendono minime quantità di DNA o RNA, le replicano molte volte, in modo da poter evidenziare piccole tracce di un microrganismo in un campione, senza dover eseguire la coltura. Queste tecniche sono particolarmente utili per i microrganismi difficili da coltivare o da identificare con altri metodi (p. es., virus, patogeni intracellulari obbligati, funghi, micobatteri, altri batteri) o che sono presenti in numero limitato.

Questi test possono coinvolgere

  • Amplificazione dell'obiettivo (p. es., RT-PCR [Real Time, Polymerase Chain Reaction], amplificazione con dislocamento dell'elica, amplificazione della trascrizione)

  • Amplificazione del segnale (p. es., test del DNA ramificato, cattura dell'ibrido)

  • Amplificazione della sonda (p. es., reazione a catena della ligasi, cleavase-invader, cycling probes)

  • Analisi post-amplificazione (p. es., sequenziamento dei prodotti amplificati, analisi microarray, e analisi della curva di dissociazione, come viene fatto nella RT-PCR [Real Time, Polymerase Chain Reaction])

La raccolta del campione e una conservazione adeguata prima dell'arrivo al laboratorio di diagnostica molecolare sono fondamentali. Poiché i metodi di amplificazione sono particolarmente sensibili, si verificano facilmente false positività conseguenti a tracce di contaminanti nel campione o nelle attrezzature.

Malgrado l'alta sensibilità, talvolta si verificano falsi negativi anche nei pazienti sintomatici (p. es., virus West Nile). I falsi negativi possono essere minimizzati mediante le seguenti:

  • Evitare l'uso di tamponi con aste in legno o punte di cotone (deve essere utilizzato un tampone validato per il test di amplificazione)

  • Trasporto rapido dei campioni

  • Raffreddamento o congelamento se il trasporto richiede probabilmente > 2 h

Il congelamento è il metodo di conservazione tipico per i saggi di amplificazione degli acidi nucleici. Tuttavia, i campioni devono essere refrigerati e non congelati, se si sospetta la presenza di virus labili (p. es., virus varicella-zoster, il virus dell'influenza, HIV-2) o se bisogna fare anche delle colture virali (i campioni congelati potrebbero essere non utilizzabili per le culture standard).

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