L'indagine microscopica ottica può essere eseguita velocemente, ma la sua accuratezza dipende dall'esperienza del microscopista e dalla qualità dell'attrezzatura. Di regola si limita l'uso del microscopio a scopo diagnostico da parte del clinico all'esterno di un laboratorio certificato.
L'esame al microscopio del tessuto può essere richiesto per distinguere la malattia invasiva da colonizzazione di superficie, una distinzione non facile da realizzare con i metodi di coltura.
La maggior parte dei campioni viene trattata con colorazioni che evidenziano i patogeni, facendoli risaltare dallo sfondo, inoltre possono essere utilizzate esami a fresco di campioni non colorati per identificare miceti e alcuni altri patogeni.
Il medico richiede una colorazione sulla base dei patogeni probabili. Tuttavia, nessuna colorazione è specifica al 100% (ossia, diversi microrganismi possono colorarsi in modo simile). La maggior parte dei campioni viene trattata con la colorazione di Gram e, se si sospetta la presenza di micobatteri, con una colorazione acidoresistente. Tuttavia, alcuni patogeni non sono facilmente visibili utilizzando tali colorazioni; se si sospettano questi agenti patogeni, sono necessarie altre colorazioni o altre metodiche di identificazione.
Siccome l'identificazione microscopica richiede solitamente una concentrazione microbica di almeno 1 ×104-5/mL, la maggior parte dei campioni di liquidi biologici (p. es., liquido cerebrospinale) vengono concentrati (p. es., per centrifugazione) prima di essere esaminati.
Colorazione di Gram
La colorazione di Gram effettua le seguenti:
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Classifica i batteri in base alla loro capacità di mantenere o meno il colorante cristal-violetto (Gram-positivo, colore blu) (Gram-negativo, colore rosso)
Mette in risalto la morfologia cellulare (p. es., bacilli, cocchi) e la disposizione cellulare (p. es., grappoli, catene, doppiette)
Identifica i leucociti polimorfonucleati, indicando un'infezione batterica piuttosto che una colonizzazione
Tali caratteristiche possono orientare la terapia antibiotica in attesa dell'identificazione definitiva. Trovare una miscela di microrganismi con diverse morfologie e caratteristiche di colorazione per la colorazione di Gram suggerisce una contaminazione del campione o un'infezione polimicrobica. Trovare molte cellule squamose in un campione di escreato suggerisce che il campione è contaminato dalla saliva e quindi è di utilità diagnostica limitata.
Per eseguire una colorazione di Gram, i tecnici fissano il campione su un vetrino mediante il calore e lo colorano con l'esposizione sequenziale al cristal-violetto, allo iodio, al decolorante, e alla controcolorazione (di solito safranina).
Colorazioni acido-resistenti e acido-resistenti modificate
Queste colorazioni sono usate per identificare i seguenti:
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Organismi acido-resistenti (Mycobacterium spp)
Microrganismi moderatamente acido-resistenti (prevalentemente Nocardia spp)
Rhodococcus e generi correlati
Oocisti di alcuni parassiti (p. es., Cryptosporidium, microsporidia, Cystoisospora [Isospora] belli, Cyclospora, Balantidium coli)
Nonostante l'individuazione dei micobatteri nell'espettorato richieda la presenza di almeno 10 000 microrganismi/mL, essi sono spesso presenti a concentrazioni inferiori, così la sensibilità è scarsa. Solitamente, alcuni mL di espettorato sono decontaminati con idrossido di sodio e concentrati mediante centrifugazione per la colorazione acidoresistente. La specificità è migliore, ma alcuni microrganismi moderatamente acidoresistenti sono difficilmente distinguibili dai micobatteri.
Colorazioni fluorescenti
Le colorazioni fluorescenti permettono l'identificazione a concentrazioni più basse (< 1 × 104 cellule/mL). Esempi sono
Arancio di acridina (batteri e funghi)
Auramina-rodamina e auramina O (micobatteri)
Bianco calcofluoro (funghi, specialmente dermatofiti)
L'associazione di un colorante fluorescente a un anticorpo diretto contro un patogeno (immunofluorescenza diretta o indiretta) aumenta teoricamente la sensibilità e la specificità. Tuttavia, questi test sono difficili da leggere e interpretare, e pochi (p. es., test anticorpi a fluorescenza diretta per Pneumocystis e Legionella) sono disponibili in commercio e comunemente utilizzati.
Preparati a fresco
I preparati a fresco di campioni non colorati possono essere utilizzati per rilevare quanto segue tramite microscopia a campo scuro:
Parassiti (comprese uova e larve di elminto)
Cellule traccia vaginali (clue cells) (presenti nella vaginosi batterica)
Organismi mobili (p. es., Trichomonas)
Treponema spirochete (presente nella sifilide)
La visibilità dei funghi può essere aumentata mediante applicazione di idrossido di potassio (KOH) al 10% per sciogliere i tessuti circostanti e microrganismi non fungali.
Colorazione con inchiostro di china (carbonio colloidale)
La macchia d'inchiostro dell'India è utilizzata per rilevare principalmente Cryptococcus neoformans e altri funghi incapsulati in una sospensione di cellule (p. es., sedimenti del liquido cerebrospinale). Viene colorato sia lo sfondo che il microrganismo stesso, in tal modo viene resa visibile la capsula intorno ad esso, la quale appare come un alone. Nel liquido cerebrospinale, il test non è così sensibile come l'antigene criptococcico. Anche la specificità è limitata; i leucociti possono apparire capsulati.
Colorazione di Warthin-Starry e Dieterle
Queste colorazioni con l'argento sono utilizzate per visualizzare batteri come
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CDC/Sherif Zaki, M.D. Ph.D.; DVBD/SCIENCE PHOTO LIBRARY
Bartonella henselae (la causa della malattia da graffio di gatto)
Colorazione di Wright e di Giemsa
Queste colorazioni sono usate per identificare i seguenti:
By permission of the publisher. From Tefferi A, Li C. In Atlas of Clinical Hematology. Edited by JO Armitage. Philadelphia, Current Medicine, 2004.
Parassiti nel sangue
Histoplasma capsulatum in fagociti e in cellule del tessuto
Inclusioni intracellulari formate da virus e clamidia
Trofozoiti di Pneumocystis jirovecii
Alcuni batteri intracellulari
Colorazione tricromica (colorazione di Gomori-Wheatley) e colorazione con ematossilina ferrica
Queste colorazioni sono usate per identificare i protozoi intestinali.
La colorazione di Gomori-Wheatley viene utilizzata per individuare i microsporidi. È possibile perdere le uova e le larve di elminti e non identificare in modo affidabile il Cryptosporidium. I funghi e le cellule umane assorbono il colorante.
L'ematossilina ferrica colora in modo differenziale le cellule, le inclusioni cellulari e i nuclei. Le uova di elminti possono assumere una colorazione troppo scura per consentirne l'identificazione.
