L'esame al microscopio del tessuto può essere richiesto per distinguere la malattia invasiva da colonizzazione di superficie, una distinzione non facile da realizzare con i metodi di coltura.
La maggior parte dei campioni viene trattata con colorazioni che evidenziano i patogeni, facendoli risaltare dallo sfondo, inoltre possono essere utilizzate esami a fresco di campioni non colorati per identificare miceti e alcuni altri patogeni.
Il medico richiede una colorazione sulla base dei patogeni probabili. Tuttavia, nessuna colorazione è specifica al 100% (ossia, diversi microrganismi possono colorarsi in modo simile). La maggior parte dei campioni viene trattata con la colorazione di Gram e, se si sospetta la presenza di micobatteri, con una colorazione acidoresistente. Tuttavia, alcuni patogeni non sono facilmente visibili utilizzando tali colorazioni; se si sospettano questi agenti patogeni, sono necessarie altre colorazioni o altre metodiche di identificazione.
Siccome l'identificazione microscopica richiede solitamente una concentrazione microbica di almeno 1 × 104-5/mL, la maggior parte dei campioni di liquidi biologici (p. es., liquido cerebrospinale) vengono concentrati (p. es., per centrifugazione) prima di essere esaminati.
L'indagine microscopica ottica può essere eseguita velocemente, ma la sua accuratezza dipende dall'esperienza del microscopista e dalla qualità dell'attrezzatura. Di regola si limita l'uso del microscopio a scopo diagnostico da parte del clinico all'esterno di un laboratorio certificato.
Colorazione di Gram
La colorazione di Gram effettua quanto segue:
Classifica i batteri in base alla loro capacità di ritenere o meno il colorante cristal-violetto (Gram-positivo, colore blu) (Gram-negativo, colore rosso)
Mette in risalto la morfologia cellulare (p. es., bacilli, cocchi) e la disposizione cellulare (p. es., grappoli, catene, doppiette)
Identifica i leucociti polimorfonucleati, indicando un'infezione batterica piuttosto che una colonizzazione
Tali caratteristiche possono orientare la terapia antibiotica in attesa dell'identificazione definitiva. Trovare una miscela di microrganismi con diverse morfologie e caratteristiche di colorazione per la colorazione di Gram suggerisce una contaminazione del campione o un'infezione polimicrobica. Trovare molte cellule squamose in un campione di escreato suggerisce che il campione è contaminato dalla saliva e quindi è di utilità diagnostica limitata.
Per eseguire una colorazione di Gram, i tecnici fissano il campione su un vetrino mediante il calore e lo colorano con l'esposizione sequenziale al cristal-violetto, allo iodio, al decolorante, e alla controcolorazione (di solito safranina).
Questa immagine è una micrografia ottica di E. coli colorati da Gram, batteri mobili, a forma di bastoncello. Il loro colore rosso indica che sono Gram-negativi. L'ingrandimento è 400X a una dimensione di 35 mm.
Questa immagine è una micrografia ottica con colorazione di Gram di S. pneumoniae (noto anche come S. pneumococcus), sono batteri arrotondati (cocchi) che di solito si presentano in coppie e talvolta in catene corte. Il loro colore blu indica che sono Gram-positivi. L'ingrandimento è di 1450X quando viene stampato largo 10 cm.
Colorazioni acido-resistenti e acido-resistenti modificate
Queste colorazioni sono usate per identificare i seguenti:
Organismi acido-resistenti (Mycobacterium spp)
Microrganismi moderatamente acido-resistenti (prevalentemente Nocardia spp)
Rhodococcus e generi correlati
Oocisti di alcuni parassiti (p. es., Cryptosporidium, microsporidia, Cystoisospora [Isospora] belli, Cyclospora, Balantidium coli)
Nonostante l'individuazione dei micobatteri nell'espettorato richieda la presenza di almeno 10 000 microrganismi/mL, essi sono spesso presenti a concentrazioni inferiori, così la sensibilità è scarsa. Solitamente, alcuni mL di espettorato sono decontaminati con idrossido di sodio e concentrati mediante centrifugazione per la colorazione acidoresistente. La specificità è migliore, ma alcuni microrganismi moderatamente acidoresistenti sono difficilmente distinguibili dai micobatteri.
Questa immagine è una micrografia ottica con colorazione acidoresistente di un campione di espettorato contenente batteri M. tuberculosis. Il colore rosso che rimane dopo il trattamento con alcol acido indica che sono acidoresistenti.
Questa immagine è una micrografia ottica con colorazione modificata di Ziehl-Neelsen (colorazione di Wade-Fite) di M. leprae in una biopsia cutanea da una persona con lebbra lepromatosa. I micobatteri appaiono rossi e sono presenti in gran numero, sia singolarmente che in gruppi (globi). L'ingrandimento è 20X quando è stampato a 10 cm di larghezza.
Colorazioni fluorescenti
Le colorazioni fluorescenti permettono l'identificazione a concentrazioni più basse (< 1 × 104 cellule/mL). Esempi sono
Arancio di acridina (batteri e funghi)
Auramina-rodamina e auramina O (micobatteri)
Bianco calcofluoro (funghi, specialmente dermatofiti)
L'associazione di un colorante fluorescente a un anticorpo diretto contro un patogeno (immunofluorescenza diretta o indiretta) aumenta teoricamente la sensibilità e la specificità. Tuttavia, questi test sono difficili da leggere e interpretare, e pochi (p. es., test anticorpi a fluorescenza diretta per Pneumocystis e Legionella) sono disponibili in commercio e comunemente utilizzati.
Questa immagine è una colorazione con anticorpi a immunofluorescenza diretta utilizzando anticorpi monoclonali che hanno come bersaglio P. jirovecii in un campione di lavaggio broncoalveolare di una persona con un cancro.
Preparati a fresco
I preparati a fresco di campioni non colorati possono essere utilizzati per rilevare quanto segue tramite microscopia a campo scuro:
Parassiti (comprese uova e larve di elminto)
Cellule traccia vaginali (clue cells) (presenti nella vaginosi batterica)
Organismi mobili (p. es., Trichomonas)
Spirocheti Treponema (presente nella sifilide)
La visibilità dei funghi può essere aumentata mediante applicazione di idrossido di potassio (KOH) al 10% per sciogliere i tessuti circostanti e microrganismi non fungali.
L'esame del preparato a fresco usando la soluzione fisiologica mostra grandi cellule epiteliali vaginali nucleate, piccoli batteri appena visibili e globuli bianchi di dimensioni intermedie. L'ingrandimento è 400X.
Colorazione all'inchiostro di china
La colorazione con inchiostro di china (carbone colloidale) viene utilizzata per rilevare principalmente Cryptococcus neoformans e altri funghi incapsulati in una sospensione cellulare (p. es., sedimento del liquido cerebrospinale). Viene colorato il campo di fondo, piuttosto che il microrganismo stesso, rendendo visibile la capsula intorno al microrganismo come un alone. Nel liquido cerebrospinale, il test non è così sensibile come l'antigene criptococcico. Anche la specificità è limitata; i leucociti possono apparire capsulati.
Questa immagine è una micrografia ottica colorata con inchiostro di china C. neoformans. La colorazione con inchiostro di china rende le capsule intorno ai microrganismi visibili sotto forme di un alone (anello luminoso).
Colorazione di Warthin-Starry e Dieterle
Queste colorazioni con l'argento sono utilizzate per visualizzare batteri come
Bartonella henselae (la causa della malattia da graffio di gatto)
Questa immagine mostra una micrografia ottica di una colorazione di Warthin-Starry argentica del batterio B. henselae. Con la colorazione di Warthin-Starry, appaiono come piccoli microrganismi curvi neri singolarmente o in gruppi come al centro della micrografia. Di solito si trovano in aree di necrosi e nei vasi sanguigni.
Questa immagine è una micrografia ottica con colorazione di Warthin-Starry di batteri B. burgdorferi (frecce) in un campione di tessuto cardiaco.
Colorazione di Wright e di Giemsa
Queste colorazioni sono usate per identificare i seguenti:
Parassiti nel sangue
Histoplasma capsulatum in fagociti e in cellule del tessuto
Inclusioni intracellulari formate da virus e clamidia
Trofozoiti di Pneumocystis jirovecii
Alcuni batteri intracellulari
Le colorazioni di Wright-Giemsa sono miscele di coloranti basici (blu di metilene) che colorano di blu e di coloranti acidi (eosina) che colorano di rosso. Pertanto, i componenti acidi della cellula (nucleo, RNA citoplasmatico, granuli basofili) si colorano di blu o di viola e i componenti basici della cellula (emoglobina, granuli eosinofili) si colorano di rosso o di arancione.
Colorazione tricromica (colorazione di Gomori-Wheatley) e colorazione con ematossilina ferrica
Queste colorazioni sono usate per identificare i protozoi intestinali.
La colorazione di Gomori-Wheatley viene utilizzata per individuare i microsporidi. Può non rilevare uova e le larve di elminti e non identificare in modo affidabile il Cryptosporidium. I funghi e le cellule umane assorbono il colorante.
L'ematossilina ferrica colora in modo differenziale le cellule, le inclusioni cellulari e i nuclei. Le uova di elminti possono assumere una colorazione troppo scura per consentirne l'identificazione.
Questa immagine mostra specie di Blastocystis colorate con tricromia.
