Eine Lichtmikroskopie kann rasch durchgeführt werden, die Genauigkeit hängt von der Erfahrung des Untersuchers und der Qualität der Ausstattung ab. Die Anwendung der Mikroskopie durch Ärzte außerhalb zertifizierter Laboratorien wird häufig durch Bestimmungen limitiert.
Eine mikroskopische Untersuchung des Gewebes kann erforderlich sein, um invasive Erkrankungen von oberflächlichen Kolonisation zu unterscheiden — eine Unterscheidung ist nicht einfach durch Kulturmethoden zu erreicht.
Die meisten Proben werden mit Farbpathogenen behandelt, wodurch sie sich vom Hintergrund abheben, obwohl "wet mounts" von ungefärbten Proben zum Nachweis von Pilzen und bestimmten anderen Krankheitserregern verwendet werden kann.
Der Arzt ordnet auf der Grundlage der wahrscheinlichen Erreger eine Färbung an. Allerdings ist keine Färbung 100% spezifisch (d. h., verschiedene Organismen können sich ähnlich färben). Die meisten Proben werden nach Gram gefärbt sowie auf säurefeste Stäbchen, wenn Mykobakterien vermutet werden. Trotzdem sind manche Erreger bei diesen Färbungen nicht leicht zu erkennen; bei Verdacht auf diese Erreger sind Spezialfärbungen oder andere Nachweismethoden erforderlich.
Da ein mikroskopischer Erregernachweis in der Regel eine Erregerkonzentration von mindestens 1 ×104-5/ml erfordert, werden die meisten Proben von Körperflüssigkeiten (z. B. Liquor) vor der Untersuchung angereichert (z. B. durch Zentrifugation).
Gram-Färbung
Die Gramfärbung tut Folgendes:
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Klassifiziert Bakterien danach, ob sie in der Lage sind, Kristallviolettfarbstoff zurückzuhalten (grampositiv – blau) oder nicht (gramnegativ – rot)
Hebt die Zellform (z. B. Stäbchen oder Kokken) sowie die Zellanordnung (z. B. Haufen, Ketten, Diploide) hervor.
Identifiziert polymorphonukleare Leukozyten, was eher auf eine bakterielle Infektion als auf eine Kolonisation hinweist
Diese Charakteristika können wegweisend für eine Antibiotikatherapie sein, bevor die endgültige Erregeridentifikation feststeht. Die Suche nach einer Mischung aus Mikroorganismen mit mehreren Morphologie und Färbungscharakteristiken auf Gram-Färbung deutet auf eine kontaminierte Probe oder polymikrobielle bakterielle Infektion hin. Wenn viele Plattenepithelkarzinome in einer Auswurfprobe gefunden werden, deutet dies darauf hin, dass die Probe mit Speichel kontaminiert ist und daher nur von begrenztem diagnostischem Nutzen ist.
Um eine Gram-Färbung durchzuführen, hitzefixieren Techniker das Probematerial auf einem Objektträger und färben es nacheinander mit Kristallviolett, jodhaltiger Lugol-Lösung (Fixation), Alkohol (Entfärbung) und Gegenfärbung (normalerweise Safranin).
Färbung auf säurefeste Stäbchen und modifiziert säurefeste Stäbchen
Diese Färbungen werden zum Nachweis von Folgendem verwendet:
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Säurebeständige Organismen (Mycobacterium spp)
Partiell säurefeste Bakterien (insbesondere Nocardia spp)
Rhodococcus und verwandte Gattungen
Oozysten von einigen Parasiten (z. B. Cryptosporidium, Mikrosporidien, Cystoisospora [Isospora] belli, Cyclospora, Balantidium coli)
Der Nachweis von Mykobakterien im Sputum erfordert mindestens 10.000 Erreger/ml; trotzdem ist die Sensitivität der Untersuchung limitiert, da Mykobakterien oft nur in niedrigen Keimzahlen vorkommen. In der Regel werden mehrere ml Sputum mit Natriumhydroxid dekontaminiert und durch Zentrifugation für säurefeste Färbung konzentriert. Die Spezifität ist besser, obwohl einige partiell säurefeste Stäbchen nur schwer von Mykobakterien zu unterscheiden sind.
Fluoreszenzfärbungen
Fluoreszierende Färbungen erlauben den Nachweis geringer Keimzahlen (< 1 × 104 Zellen/ml). Beispiele sind
Acridinorange (Bakterien und Pilze)
Auramin-Rhodamin und Auramin O (Mykobakterien)
Calcofluor weiß (Pilze, insbesondere Dermatophyten)
Die Kopplung eines Fluoreszenzfarbstoffs an einen gegen einen Mikroorganismus gerichteten Antikörper (direkte oder indirekte Immunfluoreszenz) sollte theoretisch die Sensitivität und Spezifität erhöhen. Allerdings sind diese Tests schwer zu lesen und zu interpretieren, und nur wenige (z. B. Pneumocystis und Legionella direkte Fluoreszenz-Antikörper-Tests) sind kommerziell erhältlich und allgemein verwendet.
Nativpräparate
Nativpräparate von ungefärbten Proben können verwendet werden, um mittels Dunkelfeldmikroskopie Folgendes festzustellen:
Parasiten (einschließlich Helmeier und Larven)
Vaginale Hinweiszellen (vorhanden bei bakterielle Vaginose)
Bewegliche Organismen (z. B. Trichomonas)
Treponema spirochetes (vorhanden bei Syphilis)
DieSichtbarkeit von Pilzen kann durch Anwendung von 10% Kaliumhydroxid (KOH) erhöht werden, um das umgebende Gewebe und nichtfungale Erreger aufzulösen.
Tuschepräparat (kolloidaler Kohlenstoff):
Tuschefärbung wird insbesondere zum Nachweis von Cryptococcus neoformans und anderen bekapselten Pilzen in einer Zellsuspension (z. B. Liquorsediment) verwendet. Der Hintergrund ist gegenüber dem Erreger angefärbt, sodass Kapseln um den Erreger als Halo sichtbar sind. In Liquor ist der Test nicht so sensitiv wie der Kryptokokken-Antigennachweis. Auch die Spezifität ist limitiert, Leukozyten können bekapselt erscheinen.
Warthin-Starry-Färbung und Dieterle-Färbung
Diese Silberflecken werden verwendet, um Bakterien zu visualisieren, wie
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CDC/Sherif Zaki, M.D. Ph.D.; DVBD/SCIENCE PHOTO LIBRARY
Bartonella henselae (Die Ursache für Katzenkratzkrankheit)
May-Grünwald-Färbung und Giemsa-Färbung
Diese Färbungen werden verwendet, um folgendes nachzuweisen:
By permission of the publisher. From Tefferi A, Li C. In Atlas of Clinical Hematology. Edited by JO Armitage. Philadelphia, Current Medicine, 2004.
Parasites im Blut
Histoplasma capsulatum bei Phagozyten und Gewebezellen
Intrazelluläre Einschlüsse durch Viren und Chlamydien
Trophozoiten von Pneumocystis jirovecii
Einige intrazelluläre Bakterien
Trichrom-Färbung (Gomori-Wheatley-Färbung) und Eisen-Hämatoxylin-Färbung
Diese Färbungen werden zum Nachweis intestinaler Protozoen verwendet.
Die Gomori-Wheatley-Färbung wird zum Nachweis von Mikrosporidien verwendet. Diese kann evtl. Wurmeier und -larven übersehen und kann Cryptosporidium nicht sicher identifizieren. Pilze und menschliche Zellen nehmen den Farbstoff auf.
Die Eisen-Hämatoxylin-Färbung färbt Zellen, Zelleinschlüsse und Kerne unterschiedlich an. Wurmeier können sich dunkel verfärben, um eine Identifikation zu ermöglichen.