Eine mikroskopische Untersuchung des Gewebes kann erforderlich sein, um invasive Erkrankungen von oberflächlichen Kolonisation zu unterscheiden — eine Unterscheidung ist nicht einfach durch Kulturmethoden zu erreicht.
Die meisten Proben werden mit Farbpathogenen behandelt, wodurch sie sich vom Hintergrund abheben, obwohl "wet mounts" von ungefärbten Proben zum Nachweis von Pilzen und bestimmten anderen Krankheitserregern verwendet werden kann.
Der Arzt ordnet auf der Grundlage der wahrscheinlichen Erreger eine Färbung an. Allerdings ist keine Färbung 100% spezifisch (d. h., verschiedene Organismen können sich ähnlich färben). Die meisten Proben werden nach Gram gefärbt sowie auf säurefeste Stäbchen, wenn Mykobakterien vermutet werden. Trotzdem sind manche Erreger bei diesen Färbungen nicht leicht zu erkennen; bei Verdacht auf diese Erreger sind Spezialfärbungen oder andere Nachweismethoden erforderlich.
Da ein mikroskopischer Erregernachweis in der Regel eine Erregerkonzentration von mindestens 1 ×104-5/ml erfordert, werden die meisten Proben von Körperflüssigkeiten (z. B. Liquor) vor der Untersuchung angereichert (z. B. durch Zentrifugation).
Eine Lichtmikroskopie kann rasch durchgeführt werden, die Genauigkeit hängt von der Erfahrung des Untersuchers und der Qualität der Ausstattung ab. Die Anwendung der Mikroskopie durch Ärzte außerhalb zertifizierter Laboratorien wird häufig durch Bestimmungen limitiert.
Gramfärbung
Die Gramfärbung tut Folgendes:
Klassifiziert Bakterien danach, ob sie in der Lage sind, Kristallviolettfarbstoff zurückzuhalten (grampositiv – blau) oder nicht (gramnegativ – rot)
Hebt die Zellform (z. B. Stäbchen oder Kokken) sowie die Zellanordnung (z. B. Haufen, Ketten, Diploide) hervor.
Identifiziert polymorphonukleare Leukozyten, was eher auf eine bakterielle Infektion als auf eine Kolonisation hinweist
Diese Charakteristika können wegweisend für eine Antibiotikatherapie sein, bevor die endgültige Erregeridentifikation feststeht. Die Suche nach einer Mischung aus Mikroorganismen mit mehreren Morphologie und Färbungscharakteristiken auf Gram-Färbung deutet auf eine kontaminierte Probe oder polymikrobielle bakterielle Infektion hin. Wenn viele Plattenepithelkarzinome in einer Auswurfprobe gefunden werden, deutet dies darauf hin, dass die Probe mit Speichel kontaminiert ist und daher nur von begrenztem diagnostischem Nutzen ist.
Um eine Gram-Färbung durchzuführen, hitzefixieren Techniker das Probematerial auf einem Objektträger und färben es nacheinander mit Kristallviolett, jodhaltiger Lugol-Lösung (Fixation), Alkohol (Entfärbung) und Gegenfärbung (normalerweise Safranin).
Dieses Bild ist eine Lichtmikroskopaufnahme von gramgefärbten E. coli, stäbchenförmigen, beweglichen Bakterien. Ihre rote Farbe zeigt an, dass sie gramnegativ sind. Die Vergrößerung beträgt 400-fach bei einer Größe von 35 mm.
Diese Abbildung ist eine lichtmikroskopische Aufnahme von gramgefärbten S. pneumoniae (auch bekannt als S. pneumococcus), abgerundeten Bakterien (Kokken), die in der Regel paarweise und manchmal in kurzen Ketten auftreten. Ihre blaue Farbe zeigt an, dass sie grampositiv sind. Die Vergrößerung beträgt das 1450-Fache bei einer Druckbreite von 10 cm.
Färbung auf säurefeste Stäbchen und modifiziert säurefeste Stäbchen
Diese Färbungen werden zum Nachweis von Folgendem verwendet:
Säurebeständige Organismen (Mycobacterium-Spezies)
Partiell säurefeste Bakterien (insbesondere Nocardia spp)
Rhodococcus und verwandte Gattungen
Oozysten von einigen Parasiten (z. B. Cryptosporidium, Mikrosporidien, Cystoisospora [Isospora] belli, Cyclospora, Balantidium coli)
Der Nachweis von Mykobakterien im Sputum erfordert mindestens 10.000 Erreger/ml; trotzdem ist die Sensitivität der Untersuchung limitiert, da Mykobakterien oft nur in niedrigen Keimzahlen vorkommen. In der Regel werden mehrere ml Sputum mit Natriumhydroxid dekontaminiert und durch Zentrifugation für säurefeste Färbung konzentriert. Die Spezifität ist besser, obwohl einige partiell säurefeste Stäbchen nur schwer von Mykobakterien zu unterscheiden sind.
Diese Abbildung ist eine lichtmikroskopische Aufnahme einer mit Säure gefärbten Sputumprobe, die M.-tuberculosis-Bakterien enthält. Die rote Farbe, die nach der Behandlung mit Säure-Alkohol verbleibt, zeigt an, dass sie säurefest sind.
Diese Abbildung ist eine lichtmikroskopische Aufnahme von modifiziertem, nach Ziehl-Neelsen gefärbtem (Wade-Fite-Färbung) M. leprae in einer Hautbiopsie von einer Person mit lepromatöser Lepra. Die Mykobakterien erscheinen rot und sind in großer Zahl vorhanden, sowohl einzeln als auch in Clustern (Globi). Die Vergrößerung beträgt das 20-Fache bei einer Druckbreite von 10 cm.
Fluoreszenzfärbungen
Fluoreszierende Färbungen erlauben den Nachweis geringer Keimzahlen (< 1 × 104 Zellen/ml). Beispiele sind
Acridinorange (Bakterien und Pilze)
Auramin-Rhodamin und Auramin O (Mykobakterien)
Calcofluor weiß (Pilze, insbesondere Dermatophyten)
Die Kopplung eines Fluoreszenzfarbstoffs an einen gegen einen Mikroorganismus gerichteten Antikörper (direkte oder indirekte Immunfluoreszenz) sollte theoretisch die Sensitivität und Spezifität erhöhen. Allerdings sind diese Tests schwer zu lesen und zu interpretieren, und nur wenige (z. B. Pneumocystis und Legionella direkte Fluoreszenz-Antikörper-Tests) sind kommerziell erhältlich und allgemein verwendet.
Bei dieser Abbildung handelt es sich um eine direkte Immunfluoreszenz-Antikörperfärbung mit monoklonalen Antikörpern gegen P. jirovecii in einer bronchoalveolären Lavage-Probe einer Person mit Krebs.
Nativpräparate
Nativpräparate von ungefärbten Proben können verwendet werden, um mittels Dunkelfeldmikroskopie Folgendes festzustellen:
Parasiten (einschließlich Helmeier und Larven)
Vaginale Hinweiszellen (vorhanden bei bakterielle Vaginose)
Bewegliche Organismen (z. B. Trichomonas)
Treponema spirochetes (vorhanden bei Syphilis)
DieSichtbarkeit von Pilzen kann durch Anwendung von 10% Kaliumhydroxid (KOH) erhöht werden, um das umgebende Gewebe und nichtfungale Erreger aufzulösen.
Die Untersuchung mit Kochsalzlösung im Nativpräparat zeigt große kernhaltige vaginale Plattenepithelzellen, kleine, kaum sichtbare Bakterien und mittelgroße Leukozyten. Die Vergrößerung beträgt 400X.
Tuschefärbung
Tuschefärbung (kolloidale Kohle) wird insbesondere zum Nachweis von Cryptococcus neoformans und anderen bekapselten Pilzen in einer Zellsuspension (z. B. Liquorsediment) verwendet. Der Hintergrund ist gegenüber dem Erreger angefärbt, sodass Kapseln um den Erreger als Halo sichtbar sind. In Liquor ist der Test nicht so sensitiv wie der Kryptokokken-Antigennachweis. Auch die Spezifität ist limitiert, Leukozyten können bekapselt erscheinen.
Dieses Bild ist eine lichtmikroskopische Aufnahme von mit Tusche gefärbtem C. neoformans. Tuschefärbung macht die Kapseln um die Organismen als Halo (leuchtender Ring) sichtbar.
Warthin-Starry-Färbung und Dieterle-Färbung
Diese Silberflecken werden verwendet, um Bakterien zu visualisieren, wie
Bartonella henselae (Die Ursache für Katzenkratzkrankheit)
Dieses Bild zeigt eine lichtmikroskopische Aufnahme von mit Warthin-Starry-Silber gefärbten B. henselae-Bakterien. In der Warthin-Starry-Färbung erscheinen sie als kleine, schwarz gekrümmte Organismen, entweder einzeln oder in Gruppen, wie in der Mitte des Bildes. Sie sind in der Regel in Nekrosebereichen und in Blutgefäßen zu finden.
Diese Abbildung ist eine lichtmikroskopische Aufnahme von Warthin-Starry-gefärbten B. burgdorferi-Bakterien (Pfeile) in einer Probe von Herzgewebe.
Wright-Färbung und Giemsa-Färbung
Diese Färbungen werden verwendet, um folgendes nachzuweisen:
Parasites im Blut
Histoplasma capsulatum bei Phagozyten und Gewebezellen
Intrazelluläre Einschlüsse durch Viren und Chlamydien
Trophozoiten von Pneumocystis jirovecii
Einige intrazelluläre Bakterien
Wright-Giemsa-Färbungen sind Gemische basischer Farbstoffe (Methylenblau), die blau anfärben, und saurer Farbstoffe (Eosin), die rot anfärben. So färben sich saure Komponenten der Zelle (Zellkern, zytoplasmatische RNA, basophile Granulate) blau oder violett und grundlegende Bestandteile der Zelle (Hämoglobin, eosinophile Granulate) färben sich rot oder orange.
Trichrom-Färbung (Gomori-Wheatley-Färbung) und Eisen-Hämatoxylin-Färbung
Diese Färbungen werden zum Nachweis intestinaler Protozoen verwendet.
Die Gomori-Wheatley-Färbung wird zum Nachweis von Mikrosporidien verwendet. Diese kann evtl. Wurmeier und -larven übersehen und kann Cryptosporidium nicht sicher identifizieren. Pilze und menschliche Zellen nehmen den Farbstoff auf.
Die Eisen-Hämatoxylin-Färbung färbt Zellen, Zelleinschlüsse und Kerne unterschiedlich an. Wurmeier können sich dunkel verfärben, um eine Identifikation zu ermöglichen.
Diese Abbildung zeigt trichromgefärbte Blastocystis-Spezies.
