Может потребоваться микроскопическое исследование тканей, чтобы отличить инвазивное заболевание от поверхностной колонизации — это различие сложно установить с помощью метода культивирования.
Большинство образцов обрабатывают специальными красителями, которые окрашивают болезнетворные микроорганизмы, что позволяет выделить их на общем фоне, хотя для выявления грибов и некоторых других патогенов, также могут использоваться влажные препараты неокрашенных образцов.
Врач назначает проведение окрашивания, основанное на вероятных возбудителях. Тем не менее, никакое окрашивание не является на 100% специфичным (т.е., различные микроорганизмы могут окрашиваться одинаково). Большинство образцов обрабатывают окрашиванием по Граму, а если подозреваются микобактерии, то кислотостойким окрашиванием. Однако некоторые болезнетворные микроорганизмы нелегко увидеть при использовании этих методов, тогда в таких случаях требуются различные варианты окрашивания или другие методы идентификации.
Поскольку микроскопическое обнаружение обычно требует концентрации микробов по меньшей мере около 1 ×104-5/мл, большинство образцов биологической жидкости (например, спинномозговая жидкость) перед исследованием концентрируются (например, центрифугированием).
Световая микроскопия может быть сделана быстро, но точность зависит от опыта работника лаборатории и качества оборудования. Инструкции часто ограничивают использование врачами микроскопии в диагностических целях вне сертифицированной лаборатории.
Окрашивание по Граму
Окрашивание по Граму обеспечивает следующее:
Классифицирует бактерии в соответствии с тем, дают ли они прочное соединение с кристаллвиолетом при окрашивании этим красителем или нет (грамположительные окрашиваются в синий цвет, грамотрицательные – в красный)
Позволяет определить морфологию клеток (например, бациллы, кокки) и их расположение относительно друг друга (например, скопления, цепочки, диплоиды)
Идентифицируют полиморфноядерные лейкоциты, указывая на бактериальную инфекцию, а не на колонизацию
Данные характерные черты микроорганизмов могут быть основанием для назначения той или иной антибактериальной терапии в период, предшествующий окончательной идентификации. После окраски по Граму обнаружение в образце смеси микроорганизмов с различными морфологическими характеристиками и окрашиванием предполагает зараженный образец или полимикробный характер бактериальной инфекции. Обнаружение большого количества плоскоклеточных клеток в образце мокроты позволяет предположить, что он загрязнен слюной и поэтому имеет ограниченную диагностическую ценность.
Для окрашивания по Граму лаборанты фиксируют материал образца на предметном стекле путем нагревания, а затем окрашивают его, последовательно обрабатывая образец кристаллическим фиолетовым красителем Грама, йодом, обесцвечивающим реагентом и контрастирующим красителем (как правило, сафранином).
Это изображение представляет собой световую микрофотографию окрашенной по Граму E. coli, палочковидной подвижной бактерии. Синие окрашивание указывает на то, что они являются грамотрицательными. Увеличение составляет 400X при размере 35 мм.
Это изображение является световой микрофотографией окрашенных по Граму S. pneumoniae (также известного как S. pneumococcus), округлых бактерий (кокков), которые обычно расположены парами, а иногда в виде коротких цепочек. Синие окрашивание указывает на то, что они являются грамположительными. Увеличение составляет 1450X при печати шириной 10 см.
Кислотостойкие и модифицированные кислотостойкие красители
Эти красители используются для идентификации следующих микроорганизмов:
Кислотоустойчивые микроорганизмы (вид Mycobacterium spp)
Умеренно кислотоустойчивые организмы (в первую очередь вид Nocardia spp)
Rhodococcus и связанные с ним роды
Ооцисты некоторых паразитов (например, Cryptosporidium, microsporidia Cystoisospora [Isospora] belli, Cyclospora, Balantidium coli)
Хотя обнаружение микобактерий в мокроте требует не менее 10 000 микроорганизмов/мл, а микобактерии часто присутствуют в организме человека в меньших концентрациях, таким образом, чувствительность метода весьма ограничена. Обычно несколько мл мокроты дезактивируют гидроокисью натрия и концентрируют центрифугированием для кислотостойкого окрашивания. Это улучшает диагностику, хотя некоторые умеренно кислотостойкие организмы трудно отличить от микобактерий.
Это изображение является световой микрофотографией образца мокроты, окрашенного методом кислотостойкого окрашивания, содержащего микобактерии туберкулеза. Красная окраска, которая сохраняется после обработки кислым спиртом, указывает на то, что они кислотоустойчивы.
Это изображение является световой микрофотографией M. leprae, окрашенного по Цилю-Нильсену в модификации Уэйда-Фите, в биоптате кожи человека с лепроматозной лепрой. Микобактерии имеют красный цвет и присутствуют в большом количестве как одиночно, так и в скоплениях (комки). Увеличение составляет 20Х при печати шириной 10 см.
Флуоресцентное окрашивание
Флуоресцентное окрашивание позволяют обнаружить возбудителей при более низких концентрациях (< 1 × 104 клеток/мл). Примеры:
Акридиновый оранжевый (бактерии и грибы)
Аурамин-родамин и аурамин О (микобактерии)
Калькофлюор белый (грибы, особенно дерматофиты)
Соединение флуоресцентного красителя с антителом, направленным на болезнетворный микроорганизм (прямая или непрямая иммунофлюоресценция), увеличивает чувствительность и специфичность диагностики. Однако эти анализы трудно читать и интерпретировать, и немногие (например, прямые флуоресцентные анализы антител Pneumocystis и Legionella) коммерчески доступны и обычно используются.
Это изображение представляет собой прямое иммунофлюоресцентное окрашивание антител с использованием моноклональных антител против P. jirovecii в образце бронхоальвеолярного лаважа пациента с раком.
Срезы нефиксированной ткани (влажные препараты)
Срез нефиксированной ткани неокрашенных образцов может быть использован с помощью темнопольной микроскопии для обнаружения следующего:
Паразиты (включая яйца гельминтов и личинки)
Вагинальные ключевые клетки (присутствующие при бактериальном вагинозе)
Подвижные организмы (например, трихомонады)
Спирохеты Treponema (присутствуют при сифилисе)
Обнаружение грибков может быть улучшено применением 10%-ной гидроокиси калия, чтобы растворить окружающие ткани и негрибковые организмы.
Окрашивание тушью
Окрашивание тушью (коллоидный углерод) используется, чтобы обнаружить главным образом Cryptococcus neoformans и другие инкапсулированные грибки в клеточной суспензии (например, осадок спинномозговой жидкости). Окрашивается второстепенная область, а не организм непосредственно, что дает возможность увидеть любую капсулу вокруг организма как ореол. В спинномозговой жидкости тест не столь чувствителен, как при обнаружении криптококкового антигена. Специфичность метода также ограничена: лейкоциты могут казаться скрытыми возбудителями.
Это изображение представляет собой световую микрофотографию окрашенного китайской тушью C. neoformans. Окрашивание тушью делает капсулы вокруг микроорганизмов видимыми как ореол (светящееся кольцо).
Серебрение по методам Вартин-Старри и Дитерле
Данное окрашивание используется для визуализации таких бактерий, как
Bartonella henselae (возбудитель болезни кошачьих царапин)
На этом изображении показана световая микрофотография бактерии B. henselae, окрашеной серебром по Уортин-Старри. При окрашивании по Вартину-Старри они выглядят как маленькие черные изогнутые микроорганизмы, либо одиночные, либо в виде скоплений, как в центре микрофотографии. Обычно их обнаруживают в зонах некроза и в кровеносных сосудах.
Это изображение является световой микрофотографией окрашенных по шкале Вартин-Старри бактерий B. burgdorferi (стрелки) в образце сердечной ткани.
Окрашивание по Райту и Гимзе
Это окрашивание используется для обнаружения следующего:
Паразиты в крови
Histoplasma capsulatum в фагоцитах и клетках ткани
Внутриклеточные включения, образованные вирусами и хламидиями
Трофозоиты Pneumocystis jirovecii
Некоторые внутриклеточные бактерии
Окрашивание по Райту-Гимзе представляет собой окрашивание смесью основного красителя (метиленовый синий), окрашивающего в синий цвет, и кислотного красителя (эозин), окрашивающего в красный цвет. Таким образом компоненты клетки с кислотными свойствами (ядро, цитоплазматическая РНК, базофильные гранулы) окрашиваются в синий или фиолетовый цвет, а компоненты с основными свойствами (гемоглобин, озинофильные гранулы) – в красный или оранжевый.
Трихромное окрашивание (окраска Гомори – Уитли) и окрашивание железным гематоксилином
Эти красители используются, чтобы обнаружить кишечных простейших.
Краситель Гомори – Уитли используется, чтобы обнаружить микроспоридии. Он может не выявить яйца гельминтов и их личинки; не всегда достоверно идентифицирует Cryptosporidium. Грибы и клетки человека также окрашиваются.
Железный гематоксилин дифференцированно окрашивает клетки, включения клеток и ядра. Яйца гельминтов могут окраситься в слишком темный цвет, что затрудняет идентификацию.
На этом изображении показано трихромное окрашивание представителей бластоцист.
