A microscopia óptica pode ser realizada rapidamente, mas a acurácia depende da experiência do microscopista e da qualidade do equipamento. Regulamentos muitas vezes limitam os médicos quanto ao uso de microscópio para propósitos diagnósticos em laboratórios não certificados.
O exame microscópico do tecido pode ser necessário para distinguir doença invasiva de colonização de superfície—a distinção não é facilmente alcançada por métodos de cultura.
A maioria das amostras é corada com substâncias que identificam os patógenos, diferenciando-os do meio pela cor, embora amostras a fresco não coradas possam ser utilizadas para detectar fungos e alguns parasitas.
Os médicos solicitam colorações com base nos prováveis patógenos. Entretanto, nenhuma coloração é 100% específica (isto é, diferentes organismos podem corar de maneira similar). A maioria das amostras é tratada com coloração de Gram e, em caso de suspeita de micobactéria, com coloração álcool-ácido resistente. Entretanto, alguns patógenos não são facilmente visíveis com essas colorações; se esses organismos forem suspeitos, colorações diferentes ou outros métodos de identificação devem ser utilizados.
Como a detecção por microscopia geralmente requer uma concentração microbiana de pelo menos 1 × 104-5/mL, a maioria das amostras de líquidos fisioógicos (p. ex., líquido cefalorraquidiano) são concentradas (p. ex., por centrifugação) antes de fazer o exame.
Coloração de Gram
A coloração de Gram:
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Classifica as bactérias de acordo com a retenção dos cristais de cor violeta (Gram-positivo — cor azul) ou não (Gram-negativo — cor vermelha)
Evidencia a morfologia celular (p. ex., bacilo ou coco) e os arranjos celulares (p. ex., isolados, em cadeias ou em duplas)
Identifica leucócitos polimorfonucleares, indicando infecção bacteriana em vez de colonização
Essas características podem orientar a terapia antibiótica, enquanto se aguarda a identificação definitiva. Encontrar uma mistura de microrganismos com várias morfologias e diferentes características pela coloração de Gram sugere amostra contaminada ou infecção bacteriana polimicrobiana. Encontrar muitas células escamosas em uma amostra de escarro sugere que a amostra está contaminada por saliva e, portanto, sua utilidade diagnóstica é limitada.
Para realizar a coloração de Gram, a amostra é fixada por calor a uma lâmina e corado por exposição sequencial ao cristal violeta do Gram, a iodo, a descolorante e contracoloração (tipicamente, safranina).
Coloração álcool-ácido resistente e álcool-ácido modificada
Essas colorações são utilizadas para identificar:
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Organismos álcool-ácido resistentes (Mycobacterium spp.)
Organismos moderadamente álcool-ácido resistentes (principalmente Nocardia spp)
Rhodococcus e gêneros relacionados
Oocistos de alguns parasitas [p. ex., Cryptosporidium, microsporídios, Cystoisospora (Isospora) belli, Cyclospora, Balantidium coli]
Embora a detecção de micobactérias em escarros necessite pelo menos 10.000 organismos/mL, as micobactérias estão, na maioria das vezes, presentes em níveis menores, de forma que a sensibilidade é limitada. Em geral, alguns mL de escarro são descontaminados com hidróxido de sódio e concentrados por centrifugação para coloração álcool-ácido resistente. A especificidade é maior, embora alguns microrganismos moderadamente álcool-ácido resistentes sejam de difícil distinção das micobactérias.
Colorações fluorescentes
Os corantes fluorescentes permitem a detecção de concentrações menores (< 1 × 104 células/mL). Exemplos são
Laranja acridina (bactérias e fungos)
Auramina-rodamina e auramina O (micobactérias)
Calcofluor branco (fungos, especialmente dermatófitos)
Associando um corante fluorescente ao anticorpo de um patógeno (imunofluorescência direta ou indireta), teoricamente, a sensibilidade e a especificidade devem aumentar. Entretanto, a leitura e interpretação desses testes, e poucos (p. ex., testes de Pneumocystis e Legionella) testes fluorescentes diretos para anticorpos estão comercialmente disponíveis e são utilizados comumente.
Amostras a fresco
Amostras a fresco sem corantes podem ser utilizadas para detectar, via microscopia de campo escuro, os seguintes microrganismos:
Parasitas (inclusive ovos e larvas de helmintos)
Células indicadoras vaginais (presentes na vaginose bacteriana)
Organismos móveis (p. ex., Trichomonas)
Espiroquetas de Treponema (presentes na sífilis)
Para aumentar a visibilidade dos fungos, hidróxido de potássio (KOH) a 10% pode ser aplicado para dissolver tecidos circundantes e organismos não fúngicos.
Coloração por tinta da Índia (carbono coloidal)
Utiliza-se coloração com nanquim para detectar principalmente Cryptococcus neoformans e outros fungos encapsulados em uma suspensão de células (p. ex., sedimento do líquido cefalorraquidiano). O segundo plano, mais do que o próprio microrganismo, é corado, o que faz com que qualquer cápsula ao redor dele fique visível como um halo. No líquido cefalorraquidiano, o teste não é tão sensível quanto o antígeno criptocócico. A especificidade também é limitada; os leucócitos podem parecer encapsulados.
Coloração de Warthin-Starry e coloração de Dieterle
Essas colorações de prata são utilizadas para visualizar bactérias como
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CDC/Sherif Zaki, M.D. Ph.D.; DVBD/SCIENCE PHOTO LIBRARY
Bartonella henselae (agente etiológico da doença da arranhadura do gato)
Coloração de Wright e coloração de Giemsa
Essas colorações são utilizadas para detectar:
By permission of the publisher. De Tefferi A, Li C. In Atlas of Clinical Hematology. Edited by JO Armitage. Philadelphia, Current Medicine, 2004.
Parasitas no sangue
Histoplasma capsulatum nos fagócitos e nas células teciduais
Inclusões intracelulares formadas por vírus e clamídias
Trofozoítos de Pneumocystis jirovecii
Algumas bactérias intracelulares
Coloração com tricrômio (coloração de Gomori-Wheatley) e coloração com hematoxilina férrica
São utilizadas para detectar protozoários intestinais.
A coloração de Gomori-Wheatley é utilizada para detectar microsporídios. A coloração de Gomori-Wheatley pode não dectetar ovos de helmintos e larvas e não identifica confiavelmente Cryptosporidium. Fungos e células humanas absorvem a coloração.
A coloração com hematoxilina férrica cora diferentemente células, inclusões e núcleos. A coloração para ovos de helmintos pode ser muito escura para permitir a identificação.
