Microscopie

ParMaria T. Vazquez-Pertejo, MD, FACP, Wellington Regional Medical Center
Vérifié/Révisé oct. 2022
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    La microscopie optique est une technique rapide, mais sa fiabilité dépend de l'expérience du technicien et de la qualité de l'équipement. La réglementation réserve souvent l'utilisation du microscope à visée diagnostique aux laboratoires agréés.

    L'examen microscopique des tissus peut être nécessaire pour distinguer la maladie invasive d'une colonisation de surface; une distinction qui n'est pas aisément obtenue par les cultures.

    La plupart des prélèvements nécessitent une coloration qui met en évidence les microrganismes pathogènes; bien qu'un montage humide sous hydroxyde de potassium non coloré permette de détecter des champignons et d'autres pathogènes.

    Le médecin choisit une coloration en fonction des microrganismes pathogènes potentiellement présents. Cependant, aucune coloration n'est spécifique à 100% (c'est-à-dire que différents microrganismes peuvent se colorer de la même façon). La plupart des prélèvements sont traités par coloration de Gram et, en cas de suspicion de mycobactéries, par coloration spécifique acido-résistante. Cependant, certains pathogènes ne sont pas bien visibles avec ces colorations; si de tels agents pathogènes sont suspectés, des méthodes différentes d'identification ou de coloration sont nécessaires.

    La détection par microscope nécessite habituellement une concentration d'agent d'environ au moins 1 × 104-5/mL, la plupart des liquides biologiques (p. ex., le liquide céphalorachidien) sont concentrés (p. ex., par centrifugation) avant l'examen.

    Coloration de Gram

    La coloration de Gram fait ce qui suit:

    • Classe les bactéries selon leur capacité à retenir la coloration par le cristal violet (Gram positif, couleur bleue) ou non (Gram négatif, couleur rouge)

    • Permet l'étude de la morphologie de la cellule (p. ex., bacilles ou cocci) et du type de regroupement (p. ex., amas, chaînettes, diploïdes)

    • Identifie les leucocytes polynucléaires, ce qui est en faveur d'une infection plutôt que d'une colonisation bactérienne

    Ces caractéristiques peuvent orienter le traitement antibiotique en attendant l'identification définitive. Trouver un mélange de microrganismes avec de multiples morphologies et caractéristiques de coloration au Gram évoque un échantillon contaminé ou une infection bactérienne polymicrobienne. La découverte de nombreuses cellules malpighiennes dans un prélèvement d'expectorations suggère que l'échantillon est contaminé par de la salive et est d'un intérêt diagnostique limité.

    Pour effectuer une coloration de Gram, le prélèvement est fixé par la chaleur sur une lame de verre et coloré par exposition séquentielle au cristal violet de Gram, à l'iode, à un décolorant et à une coloration de contraste (en général de la safranine).

    Colorations acido-résistante et acido-résistante modifiée

    Ces colorations sont utilisées pour identifier les microrganismes suivants:

    Bien que la détection des mycobactéries dans les crachats requière au moins 10 000 microrganismes/mL, les mycobactéries sont souvent présentes à des taux moins élevés et la sensibilité du test est donc limitée. Habituellement, plusieurs mL d'expectorations sont décontaminés avec de l'hydroxyde de sodium (soude caustique) et concentrés par centrifugation en vue d'une coloration acido-résistante. Sa spécificité est en revanche meilleure, bien que certains microrganismes modérément acido-résistants soient difficiles à distinguer des mycobactéries.

    Colorations fluorescentes

    Les colorations fluorescentes permettent une détection de souches à des concentrations plus faibles (< 1 × 104 cellules/mL). Les exemples en sont

    Coloration fluorescente (Pneumocystis jirovecii)
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    Cette image est une coloration par anticorps immunofluorescence directe utilisant des anticorps monoclonaux qui ciblent P. jirovecii dans un prélèvement de lavage bronchoalvéolaire d'une personne atteinte d'un cancer.
    CDC/Image courtesy of Brigham & Women's Hospital, Boston, MA
    • Acridine orange (bactéries et champignons)

    • Auramine-rhodamine et auramine O (mycobactéries)

    • Calcofluor blanc (champignons, en particulier dermatophytes)

    Le couplage d'un marqueur fluorescent à un anticorps spécifique d'un pathogène (immunofluorescence directe ou indirecte) doit en théorie permettre d'augmenter la sensibilité et la spécificité du test. Ces tests sont cependant difficiles à lire et à interpréter et peu d'entre eux (p. ex., tests par anticorps fluorescents directs pour Pneumocystis et Legionella) sont disponibles dans le commerce ou utilisés en routine.

    Montages humides

    Des montages humides de prélèvements non colorés peuvent être utilisés pour détecter les éléments suivants par microscopie à fond noir:

    La mise en évidence des champignons peut être accrue par l'application d'hydroxyde de potassium à 10% (KOH) pour dissoudre les tissus environnants et les microrganismes non fongiques.

    Coloration à l'encre de Chine (carbone colloïdal)

    L'encre de Chine est utilisée principalement pour détecter Cryptococcus neoformans ou d'autres champignons encapsulés dans une suspension cellulaire (p. ex., culot de sédimentation du liquide céphalorachidien). Le fond, et non le microrganisme lui-même, est coloré, ce qui révèle la capsule sous forme d'un halo. Dans le liquide céphalorachidien, ce test n'est pas aussi sensible que la recherche d'antigènes solubles cryptococciques. La spécificité est également limitée; les GB peuvent apparaître encapsulés.

    Coloration à l'encre de Chine (pour Cryptococcus neoformans)
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    Cette image est une micrographie optique de C. neoformans coloré à l'encre de Chine. La coloration à l'encre de Chine rend les capsules autour des microrganismes visibles sous la forme d'un halo (anneau lumineux).
    CDC/Brinkman/SCIENCE PHOTO LIBRARY

    Coloration de Warthin-Starry et de Dieterle

    Ces colorations couleur argent sont utilisées pour visualiser des bactéries telles que

    Coloration de Wright et de Giemsa

    Ces colorations sont utilisées pour détecter ce qui suit:

    Coloration au trichrome (coloration de Gomori-Wheatley) et coloration par l'hématoxyline ferrique

    Ces colorations sont utilisées pour détecter les protozoaires intestinaux.

    Coloration au trichrome (Blastocystis spp)
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    Cette image montre des espèces de Blastocystis colorées au trichrome. Image from the Centers for Disease Control and Prevention, Global Health, Division of Parasitic Diseases and Malaria.

    La coloration de Gomori-Wheatley est utilisée pour détecter les microsporidies. La coloration de Gomori-Wheatley peut ne pas mettre en évidence les œufs et larves d'helminthes et ne permet pas une identification fiable de Cryptosporidium. Les champignons et les cellules humaines fixent le colorant.

    La coloration par l'hématoxyline ferrique différencie les cellules, les inclusions cellulaires et les noyaux. Avec la coloration par l'hématoxyline ferrique, les œufs d'helminthes peuvent être colorés de manière trop foncée pour permettre leur identification.

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