Le Manuel MSD

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Culture

Par

Kevin C. Hazen

, PhD, Duke University Health System

Dernière révision totale juin 2018| Dernière modification du contenu juin 2018
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La culture est la croissance d'un microrganisme sur ou dans un milieu nutritionnel solide ou liquide; l'augmentation du nombre des microrganismes facilite l'identification. La culture permet également la réalisation des antibiogrammes.

La communication avec le laboratoire est essentielle. Bien que la plupart des prélèvements soit placés sur des milieux standards (p. ex., sang ou gélose chocolat), certains pathogènes nécessitent des nutriments ou des inhibiteurs spécifiques (voir tableau Milieux sélectifs pour l'isolement de bactéries communes) ou d'autres conditions particulières d'incubation (p. ex., une température, des concentrations d'oxygène ou de dioxyde de carbone ou une durée spécifiques). Si un de ces agents pathogènes plus invasifs est suspecté ou si le patient a pris des antimicrobiens, le laboratoire doit en être averti. L'origine du prélèvement doit être précisée, pour que le laboratoire puisse différencier les pathogènes de la flore normale spécifique d'un site donné.

Tableau
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Milieux sélectifs pour l'isolement de bactéries communes

Microrganisme

Milieu préféré

Bacteroides sp

Milieu standard kanamycine-vancomycine sur gélose de sang

Bacteroides fragilis

Bacteroides bile esculine (avec gentamicine et bile)

Bordetella pertussis

La gélose de Bordet-Gengou contient de la méthicilline ou de la céfalexine

Gélose de Regan-Lowe avec céfalexine

Gélose sang de cheval – charbon

Burkholderia cepacia

agar Burkholderia cepacia

Campylobacter jejuni ou C. coli

Géloses sélectives Campylobacter (p. ex., gélose à la céfopérazone-vancomycine)

Corynebacterium diphtheriae

Gélose de Tinsdale

Gélose cystine-tellurite

Milieu au sérum coagulé de Löffler

Escherichia coli ou des pathogènes entérohémorragiques (producteurs de toxine Shiga, dont les O157-H7)

Gélose MacConkey-sorbitol

Francisella tularensis

Gélose au sang ou chocolat-cystine

Legionella sp

Gélose extraite de levures charbon de bois tamponnée

Leptospira sp

Milieu de Fletcher ou de Stuart avec du sérum de lapin ou milieu pour Leptospira avec albumine sérique bovine plus du Tween 80

Neisseria gonorrhoeae ou N. meningitidis

Gélose de Thayer-Martin modifiée

Gélose de New York

Salmonella et Shigella sp

Peuvent se développer sur un milieu standard de MacConkey ou de l'éosine-bleu de méthylène

Alternative: Hektoen ou xylose lysine désoxycholate, gélose Salmonella-Shigella, milieu d'enrichissement pour Gram négatifs ou au sélénite

Vibrio sp

Gélose saccharose-sels biliaires-citrate-thiosulfate

Yersinia sp

Gélose à la cefsulodine-irgasan-novobiocine

Prélèvement d'échantillons

Le recueil des prélèvements est important. Pour le diagnostic des maladies infectieuses, une règle empirique est de prélever là où se trouve l'infection. Pour les lésions, le bord, et non le centre, doit être prélevé.

L'utilisation de tampons est déconseillée. Cependant, si un tampon est utilisé, un écouvillon est préféré car il peut récupérer plus de prélèvements. Les écouvillons utilisés pour les analyses moléculaires doivent être compatibles avec l'analyse moléculaire spécifique à laquelle ils sont destinés. Un mauvais choix du type d'écouvillon peut entraîner des résultats faussement négatifs. Les écouvillons en bois sont toxiques pour certains virus. Les écouvillons avec une extrémité en coton sont toxiques pour certaines bactéries, dont les chlamydiae.

Les hémocultures nécessitent la décontamination et la désinfection de la peau (p. ex., nettoyage à la povidone iodée, séchage, flush à l'alcool à 70%). On utilise en général plusieurs prélèvements de chaque site; ils sont prélevés presque simultanément, si possible au moment des pics de fièvre. La présence d'une flore normale de la peau qui ne se développe que sur un seul prélèvement sanguin est généralement considérée comme une contamination.

Si un prélèvement sanguin est fait à partir d'une voie centrale, il faut également procéder à un prélèvement sanguin périphérique pour différencier une bactériémie systémique d'une infection du cathéter. Les cultures provenant de cathéters infectés se positivent plus rapidement et sont plus riches en microrganismes que les hémocultures prélevées au même moment en périphérie. Certains champignons, en particulier les moisissures (p. ex., Aspergillus spp), ne peuvent habituellement pas être isolés à partir du sang.

Le prélèvement doit alors être transporté rapidement, dans un milieu adéquat, dans des conditions qui limitent la croissance de toute flore normale éventuellement contaminante. Pour permettre une quantification précise des pathogènes, il convient d'éviter la croissance d'autres germes; les prélèvements doivent être transportés au laboratoire immédiatement ou, si le transport est retardé, réfrigéré (dans la plupart des cas).

Considérations particulières pour la culture

Certaines cultures doivent se faire dans des conditions particulières.

Les bactéries anaérobies ne doivent pas être mises en culture à partir de sites où elles existent normalement, car il peut alors être impossible de différencier la flore normale et pathogène. Les prélèvements doivent être maintenus à l'abri de l'air, ce qui peut être difficile. Pour les prélèvements par écouvillon, des moyens de transport anaérobies sont disponibles. Cependant, les prélèvements liquidiens (p. ex., le contenu d'un abcès) sont de meilleure qualité que les écouvillonnages pour la récupération de bactéries anaérobies. Les prélèvements liquidiens doivent être effectués avec une seringue d'où tout l'air aura été évacué (pour minimiser le contact du prélèvement avec l'oxygène) et envoyés au laboratoire dans la seringue même (fermée sans l'aiguille) ou transférés dans un flacon de transport anaérobie.

Les mycobactéries sont difficiles à obtenir en culture. Les prélèvements renfermant une flore normale (p. ex., crachats) doivent d'abord être décontaminés et concentrés. Mycobacterium tuberculosis et d'autres mycobactéries poussent lentement. La croissance de M. tuberculosis est généralement plus rapide dans un liquide que dans un milieu solide; l'utilisation systématique de systèmes automatisés avec des milieux liquides peut permettre une croissance dans les 2 semaines versus 4 semaines sur un milieu solide tel que la gélose de Löwenstein-Jensen. En outre, il est possible que quelques microrganismes soient présents dans un prélèvement. La multiplication des prélèvements d'un même site permet d'améliorer le rendement. Les prélèvements doivent être gardés en culture pendant 8 semaines avant d'être jetés. M. ulcerans, cause de l'ulcère de Buruli, nécessite jusqu'à 12 semaines à 32° C sur gélose de Lowenstein-Jensen. Si une mycobactérie atypique est suspectée, le laboratoire doit en être informé.

Les virus sont habituellement mis en culture à partir d'écouvillons ou de prélèvements tissulaires, transportés dans un milieu contenant des antibiotiques et des antimycosiques. Les prélèvements sont inoculés sur des cultures cellulaires permettant le développement du virus recherché et inhibant tous les autres germes. Les virus très fragiles (p. ex., varicelle-zona) doivent être inoculés sur des cultures de tissus dans un délai maximum d'1 h après le prélèvement. Les cultures cellulaires standards sont très sensibles. La technique de culture en flacon, dans laquelle le prélèvement est centrifugé sur une monocouche de cellules dans un flacon, donne des résultats plus rapides (2 jours contre 7 à 14 jours). Certains virus communs ne peuvent être détectés par les méthodes de culture de routine et nécessitent d'autres méthodes diagnostiques (voir tableau Tests diagnostiques pour les virus communs qui ne poussent pas dans les cultures virales standards), comme ce qui suit:

Tableau
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Tests diagnostiques pour les virus communs qui ne poussent pas dans les cultures virales standards

Pathologies fréquentes

Virus

Examens diagnostiques

Maladie fébrile aiguë, méningo-encéphalite

Alphavirus, flavivirus, bunyavirus (p. ex., virus de l'encéphalite de St. Louis, virus de l'encéphalite de la Crosse)

Tests immunoenzymatiques, méthodes basées sur les acides nucléiques

Rotavirus, calicivirus (norovirus), astrovirus

Méthode enzymatique ou immuno-enzymatique, méthodes basées sur les acides nucléiques

Virus Epstein-Barr

Tests immunoenzymatiques, méthodes basées sur les acides nucléiques

Fièvres hémorragiques, chorioméningite lymphocytaire

Filovirus, arénavirus (p. ex., fièvre de Lassa, virus Ebola)

Tests enzymatiques, méthodes basées sur les acides nucléiques

Hépatite

Tests sérologiques, méthodes basées sur les acides nucléiques

Tests immunoenzymatiques, méthodes basées sur les acides nucléiques

Hépatite C, hépatite G

Méthodes basées sur les acides nucléiques, tests immunoenzymatiques

Roséole, sarcome de Kaposi, infections disséminées

Virus herpétiques 6, 7, 8

Méthodes basées sur les acides nucléiques, tests immunoenzymatiques

SIDA

VIH

Méthodes basées sur les acides nucléiques, tests immunoenzymatiques, Western blot

Condylomes acuminés, cancers génitaux cutanés

Méthodes basées sur les acides nucléiques, tests immunoenzymatiques

5e maladie (érythème infectieux)

Parvovirus humain B19

Méthodes basées sur les acides nucléiques, tests immunoenzymatiques

Leucémie à lymphocytes T de l'adulte

Human T-lymphotropic virus

Tests immunoenzymatiques, méthodes basées sur les acides nucléiques

Virus polyome (JC et BK)

Tests basés sur les acides nucléiques

Poxvirus

Méthodes basées sur les acides nucléiques, microscopie électronique, culture en fonction du virus

Virus de la rage

Tests en immunofluorescence, méthodes basées sur les acides nucléiques

Virus de la rubéole

Tests immunoenzymatiques, en immunofluorescence, méthodes basées sur les acides nucléiques

EIA = enzyme immunoassay (test immunoenzymatique); EM = electron microscopy (microscopie électronique); IEM = immunoelectron microscopy (microscopie immunoélectronique).

Les prélèvements fongiques provenant de sites non stériles doivent être inoculés sur un milieu contenant des agents antibactériens. Avant de les détruire, il faut laisser les prélèvements se développer pendant 3 à 4 semaines.

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