腰椎穿刺は以下を目的として行われる：
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頭蓋内圧と髄液組成を評価する（ 様々な疾患における髄液の異常）
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治療として頭蓋内圧を低下させる（例，特発性頭蓋内圧亢進症）
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髄腔内に薬剤または脊髄造影用の造影剤を投与する
様々な疾患における髄液の異常
相対的禁忌として以下のものがある：
視神経乳頭浮腫または局所神経脱落症状がみられる場合には，腰椎穿刺の前にCTまたはMRIを施行して，テント切痕ヘルニアまたは小脳ヘルニアを誘発しうる腫瘤の存在を除外すべきである（ 脳ヘルニア）。
腰椎穿刺の手技
手技は典型的には，患者を左側臥位にして行う。協力的な患者であれば，膝を抱えて可能な限り強く体を丸めてもらうようにする。この体位を維持できない患者は，介助者が患者の体を支えなければならない場合があり，あるいは，特に肥満患者では，ベッドサイドに座らせてベッドサイドテーブルにかがみ込むようにさせると，脊椎がよりよく曲がることがある。
直径20cmをヨードで消毒した後，ヨードをアルコールで拭き取り，くも膜下腔に入らないようにする。スタイレット付きの腰椎穿刺針をL3～L4またはL4～L5間に刺入する（L4棘突起は，典型的には両側の後上腸骨稜の間の線上に存在する）；刺入した針を患者の臍に向かって頭側に進め，常に床と平行となるように維持する。しばしば針がくも膜下腔に入る際に，ポンという音がする；続いてスタイレットを引き抜いて髄液を流出させる。
マノメーターで初圧を測定する；検査用に髄液を約5～10mLずつ4本のチューブに採取する。穿刺部位はその後，滅菌された絆創膏で被覆する。
約10％の頻度で腰椎穿刺後頭痛が生じる。
髄液の色
髄液の細胞数と糖およびタンパク濃度
細胞数および細胞分画と糖およびタンパク濃度は，多くの神経疾患の診断に役立つ（ 様々な疾患における髄液の異常）。
正常の場合，髄液糖/血糖比は約0.6であり，重度の低血糖の場合を除いて，髄液糖は通常50mg/dL（2.78mmol/L）を超える。
髄液タンパク値の上昇（> 50mg/dL）は疾患の指標として感度は高いが，特異度は低い；500mg/dLを超えるタンパク増加は，化膿性髄膜炎，進行した結核性髄膜炎，脊髄腫瘍による完全閉塞，または血性髄液においてみられる。グロブリン（正常では15％未満），オリゴクローナルバンド，およびミエリン塩基性タンパクに対する特殊検査は，脱髄疾患の診断に役立つ。
髄液の染色，検査，培養
感染が疑われる場合は，遠心分離した髄液沈渣を染色して，細菌（グラム染色），結核菌（抗酸菌染色または蛍光抗体染色），Cryptococcus属真菌（墨汁染色）を検索する。髄液量が多いほど（10mL），染色および培養で病原体（特に抗酸菌および特定の真菌）を検出できる可能性が高くなる。初期の髄膜炎菌性髄膜炎または重度の白血球減少症の患者では，髄液タンパクが少なすぎるためにグラム染色時にスライドガラスに細菌が付着しないことがあり，偽陰性の原因となりうる。この問題は，無菌の血清を髄液沈査に1滴混合することで予防できる。出血性髄膜脳炎が疑われる場合は，直接鏡検によりアメーバの検出を試みる。ラテックス凝集反応および共凝集試験により，細菌を迅速に同定できることがあり，特に染色および培養が陰性の場合（例，治療開始後の髄膜炎）に有用である。髄液検体では好気培養，嫌気培養，抗酸菌培養，および真菌培養を行うべきである。
エンテロウイルスを除いて，髄液からウイルスが分離されることはほとんどない。ウイルス抗体パネルが利用できる。
しばしばVDRL（Venereal Disease Research Laboratories）試験とクリプトコッカス抗原検査がルーチンに行われる。単純ヘルペスウイルスや中枢神経系に感染するその他の病原体を対象とするPCR検査が，ますます利用しやすくなっている。
