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Nukleinsäurebasierte Identifikationsmethode für Infektionskrankheiten

Von

Kevin C. Hazen

, PhD, Duke University Health System

Inhalt zuletzt geändert Jun 2018
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Nukleinsäureebasierte (molekulare) Identifizierung ist im klinischen Umfeld, üblich geworden; die schnelle Identifizierung ermöglicht es dem Patienten, sich bestimmten antimikrobiellen Therapie zu unterziehen und eine längere Behandlung mit empirischen, potenziell unwirksamen Medikamenten zu vermeiden.

Nukleinsäurebasierte Methoden erkennen erregerspezifische DNS- oder RNS-Sequenzen, die aus den Erregern extrahiert wurden. Sequenzen können teils in vitro amplifiziert werden, teils nicht.

Nuckeinsäurebasierte Methoden sind insgesamt spezifisch und hoch sensitiv und können für alle Kategorien von Erregern verwendet werden. Die Ergebnisse können sehr rasch vorliegen. Da jeder Test typischerweise für einen einzelnen Erreger spezifisch ist, muss der Kliniker die diagnostischen Möglichkeiten kennen und die Tests entsprechend anfordern. Zum Beispiel, wenn ein Patient Symptome, die auf Influenza hindeuten, aufweist, aber die Influenzasaison vorbei ist, ist es besser, einen allgemeinen viralen Test (z. B. virale Kultur) durchzuführen als einen spezifischen Grippetest, weil ein anderes Virus (z. B- Parainfluenza, Adenovirus) die Ursache sein kann.

Jüngste Fortschritte haben zur Entwicklung von Multiplex-Assays geführt, in denen ein einzelner nukleinsäurebasierter Test ≥ 2 verursachenden Mikroorganismen erkennen und zwischen diesen unterscheiden kann. Multiplex-Assays sind in der Regel weniger empfindlich als Einzielziele, qualitative Assays. Sie können auch weniger spezifisch sein. Unerwartete positive Ergebnisse, die nicht mit dem Krankheitsbild des Patienten übereinstimmen, sollten mit Vorsicht betrachtet werden. Mehrfachproben sind derzeit zur Erkennung von biologischen Kampfstoffen verfügbar.

Nukleinsäurebasierte Methoden sind qualitativ, für einige wenige, aber ansteigende Infektionen existieren aber auch quantitative Methoden (z. B. HIV, Zytomegalievirus, humanes T-Zell-Leukämievirus); diese Methoden können für die Diagnosestellung und die Überwachung des Therapieerfolgs hilfreich sein.

unverstärkte Tests

Techniken, die auf Nukleinsäuresequenzen zielen, aber keine Verstärkung dieser Sequenzen benötigen, sind gewöhnlich auf Fälle begrenzt, in welchen der Erreger bereits angezüchtet wurde oder in der Probe in hoher Zahl vorkommt (z. B. bei durch Gruppe A verursachterPharyngitisStreptococcus, bei genitaler Chlamydia trachomatis oder Neisseria gonorrhoeae).

Nukleinsäureamplifikation

Nukleinsäureamplifikationstechniken verwenden kleinste Mengen an DNS oder RNS, replizieren diese viele Male und können so winzige Spuren eines Erregers in einer Probe erkennen, was eine Kultur unnötig machen kann. Diese Techniken sind insbesondere hilfreich bei Erregern, die schwierig kulturell oder mittels anderer Verfahren nachzuweisen sind (z. B. Viren, obligat intrazelluläre Erreger, Pilze, Mykobakterien, bestimmte andere Bakterien) oder die nur in geringer Zahl vorhanden sind.

Diese Tests können beinhalten

  • Ziel-Amplifikation (z. B. Polymerase-Kettenreaktion, reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion [RT] Strang-Verdrängung- Amplifikation, Transkriptionsamplifikation)

  • Signalverstärkung (z. B. verzweigte DNA-Assays, Hybrid-Capture)

  • Probe-Amplifikation (z. B. Ligase-Kettenreaktion, Cleavase-Invasoren, Radfahren Sonden)

  • Postamplifikationsanalyse (z. B. Sequenzierung des amplifizierten Produkts, Mikroarray-Analyse und Schmelzkurvenanalyse, wie sie in Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion durchgeführt wird)

Entsprechende sind Probenentnahme und Lagerung vor der Ankunft im molekulardiagnostischen Labor kritisch. Da Amplifikationsmethoden so sensitiv sind, können aufgrund von spurenförmigen Kontaminationen leicht falsch-positive Ergebnisse vorkommen.

Trotz der hohen Sensitivität kann es manchmal auch zu falsch-negativen Ergebnissen kommen, wenn ein Patient symptomatisch ist (z. B. bei West-Nil-Virusinfektion). Falsch-negative Ergebnisse können durch Folgendes minimiert werden:

  • Vermeidung von Tupfern mit hölzernen Wellen oder Wattestäbchen (der Tupfer, der für den Amplifikation-Assay validiert wurde, muss verwendet werden)

  • Schneller Transport der Proben

  • Einfrieren oder Kühlen der Proben, wenn der Transport voraussichtlich > 2 h in Anspruch nimmt

Einfrieren ist die typische Aufbewahrungsmethode für die Nukleinsäure-Amplifikation-Assays. Allerdings sollten die Proben besser gekühlt als eingefroren werden, wenn labile Viren (z. B. Varicella-Zoster-Virus, Influenza-Virus, HIV-2) vermutet werden oder wenn Viruskulturen angelegt werden müssen (gefrorenen Proben können für Standard-Kulturen nicht verwendet werden).

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