Raccolta e processamento dei campioni per la diagnosi microscopica delle infestazioni parassitarie

Sangue

Plasmodium spp

Strisci spessi o sottili di sangue capillare (ossia, dito o orecchio, usando lancette monouso) oppure 5-10 mL di sangue fresco non coagulato (preferibilmente in provette di raccolta contenenti acido etilendiamminotetraacetico [EDTA])

Raccogliere campioni multipli durante la malattia acuta.

Preparare gli strisci dal sangue capillare o non coagulato entro 3 h dalla raccolta.

Utilizzare la colorazione di Giemsa o di Wright.

Assicurarsi che i vetrini siano puliti.

Babesia spp

Strisci spessi e sottili ematici come per le specie di Plasmodium

Raccogliere come per Plasmodium spp.

Utilizzare la colorazione di Giemsa o di Wright.

La morfologia è simile alle forme ad anello del Plasmodium spp ma senza pigmento e gametociti. Le tetradi sono diagnostiche della Babesia spp, ma sono poco frequenti.

Gli strisci spessi di sangue possono essere difficili da interpretare e devono essere eseguiti solo da un microscopista esperto. Su uno striscio di sangue può essere osservato un pattern a "croce di Malta".

Vermi filaria

Strisci spessi e sottili da 1 mL di sangue anticoagulato; se il primo campione è negativo, prelevare 5–10 mL, concentrati mediante centrifugazione o filtrazione

Microfilarie di Wuchereria bancrofti e Brugia malayi: raccogliere il sangue tra le ore 22 di sera e le 2 del mattino.

Microfilarie di Loa loa, Dipetalonema perstans, e Mansonella ozzardi: raccogliere il sangue tra le 10:00 e le 18:00.

Le filarie mostrano una periodicità diurna, pertanto i campioni devono essere ottenuti entro periodi di tempo specifici per ottimizzare la resa.

Utilizzare direttamente la colorazione di Giemsa o ematossilina-eosina o, per una maggiore sensibilità, dopo concentrazione in formalina al 2% (tecnica Knott) o dopo filtrazione attraverso una membrana di Nucleopore.

Trypanosoma spp

Striscio sottile da sangue capillare o da 5-6 mL di sangue non coagulato

Si campiona sangue capillare o non coagulato. Strisciare sui vetrini.

Per aumentare la sensibilità vengono utilizzate varie tecniche di concentrazione.

I tripanosomi mobili sono visibili nei preparati umidi; la colorazione di Giemsa (o Field) viene utilizzata per identificarli in preparati fissati.

Midollo osseo, altro tessuto reticoloendoteliale o liquido cerebrospinale

Leishmania spp (leishmaniosi viscerale)

Aspirati di midollo osseo, milza, fegato, o linfonodi o strisci dal sovranatante ("buffy coat")

Strisciare sui vetrini.

Utilizzare la colorazione Giemsa, Wright-Giemsa o ematossilina-eosina.

Naegleria

Acanthamoeba

Balamuthia

Liquido cerebrospinale fresco

Utilizzare una tecnica di raccolta asettica.

Esaminare il campione il più presto possibile.

Esaminare utilizzando la microscopia ottica o a contrasto di fase.

I parassiti possono essere individuati grazie al loro movimento; possono essere fissati e colorati con Giemsa o messi in coltura.

Trypanosoma brucei rhodesiense

Trypanosoma brucei gambiense

Aspirati dei linfonodi o da sifiloma

Liquido cerebrospinale fresco

Utilizzare una tecnica di raccolta asettica.

Utilizzare un preparato a fresco* per identificare i parassiti mobili o fissare e colorare con la colorazione di Giemsa o Field prima o dopo la concentrazione mediante centrifugazione.

Aspirato duodenale o biopsia digiunale

Giardia spp

Cryptosporidium spp

Cystoisospora spp

Cyclospora spp

Microsporidia

Strongyloides spp

Campione di aspirato duodenale o di biopsia digiunale durante endoscopia

Esaminare gli aspirati immediatamente, oppure fissarli e colorarli.

Eseguire l'esame istopatologico dei campioni bioptici.

Eseguire un esame con preparato a fresco su tampone delle secrezioni per identificare uova o larve di Strongyloides. Per una diagnosi possono essere utilizzate colorazioni multiple (vedi Feci sotto per dettagli).

La microscopia a trasmissione elettronica è stata il metodo principale per il rilevamento e l'identificazione delle specie dei microsporidi.

Biopsia rettale

Schistosoma mansoni

Schistosoma japonicum

Campione bioptico rettale dalla piega dorsale (valvola di Houston) a circa 9 cm dall'ano

Fissare per l'esame istopatologico e schiacciare un segmento tra i vetrini per aumentare la sensibilità.

La differenziazione di specie si basa sulla morfologia delle uova.

Sigmoidoscopia (rettoscopia)

Entamoeba histolytica

Raschiamenti freschi con curette o cucchiaio di Volkmann, biopsia della mucosa, o aspirato da una lesione attraverso una pipetta da 1 mL con un bulbo di gomma (i tamponi con estremità di cotone non sono soddisfacenti)

Esaminare al più presto il campione o dopo fissazione e colorazione.

Utilizzare preparati a fresco o vetrini fissi colorati (p. es., con colorazione tricromica) per rilevare trofozoiti e cisti. Nelle feci deve essere ricercato l'antigene o il DNA di E. histolytica; questi test sono più sensibili e possono discriminare l'E. histolytica dall'E. dispar e altre amebe non patogene.

Feci

Cryptosporidium spp

Esame delle uova e dei parassiti fecali su campioni multipli di feci appena emesse (≥ 3) raccolti giornalmente o a giorni alterni

Refrigerare ed esaminare i campioni freschi o conservarli in formalina o in un altro fissativo.

Manipolare con attenzione; le feci fresche e conservate in bicromato sono infettanti.

La biopsia aspirata duodenale può essere diagnostica.

Esaminare preparati a fresco mediante microscopia ottica, a contrasto di fase e in immunofluorescenza.

Colorare i campioni con colorazione acidoresistente modificata o con safranina modificata.

I test per gli antigeni fecali o per il DNA sono più sensibili.

Cyclospora spp

Esame delle uova e dei parassiti fecali su campioni multipli di feci appena emesse raccolti giornalmente o a giorni alterni

I campioni devono essere refrigerati ed esaminati freschi o congelati, o conservati in formalina al 10% e dicromato di potassio al 2,5%. Diversi test di laboratorio richiedono diverse tecniche di conservazione. Le tecniche di concentrazione aumentano la sensibilità.

Esaminare preparati a fresco mediante microscopia ottica, a contrasto di fase in campo chiaro, e in microscopia a fluorescenza con lampada UV. Le oocisti mostrano autofluorescenza alla luce UV. I campioni fissati possono essere colorati con la colorazione acidoresistente o con safranina modificata.

Un test di sporulazione può differenziare la Cyclospora dalle alghe blu-verdi.

I test per DNA nelle feci sono specifici e più sensibili.

Cystoisospora spp

Esame delle uova e dei parassiti fecali su campioni multipli di feci appena emesse raccolti giornalmente o a giorni alterni

Esaminare a fresco, o conservare in formalina o in altro fissativo. Tecniche di concentrazione per aumentare la sensibilità.

Le oocisti possono essere visualizzate in preparati a fresco mediante microscopia a contrasto di fase o microscopia a epifluorescenza.

Colorare i campioni fissati con colorazione acidoresistente modificata.

Quando le feci sono negative, l'esame dell'aspirato duodenale o di un campione bioptico può essere diagnostico.

Entamoeba dispar

Entamoeba histolytica

Altre amebe

Campioni multipli di feci appena emesse raccolte al mattino

Esaminare i campioni di feci non formate o diarroiche entro 15 min.

Conservare le feci formate refrigerate fino al momento dell'esame. Conservare in formalina o in un altro fissativo.

Utilizzare preparati a fresco e vetrini colorati permanenti (p. es., la colorazione tricromica) e le tecniche di concentrazione per le cisti.

Le feci devono essere saggiate per l'antigene o DNA della E. histolytica specifica, che è più sensibile e può differenziare l'E. histolytica dall'E. dispar, e altre amebe non patogene.

Enterobius spp

Ovuli raccolti dalla zona perianale su nastro adesivo e posizionati su un vetrino

Esame di routine delle uova e dei parassiti fecali su campioni multipli di feci appena emesse raccolti giornalmente o a giorni alterni

Raccogliere dalla zona perianale al mattino prima dell'evacuazione o del lavaggio.

Le uova di Enterobius vengono occasionalmente osservate in un campione di feci o in un campione cervicale o vaginale (p. es., come reperto occasionale in un test di Papanicolaou [Pap]).

Si possono osservare vermi adulti con l'esame della regione perianale o della vagina.

Giardia spp

Campioni multipli di feci da poco prodotte (≥ 3) raccolte al mattino a giorni alterni

Aspirati duodenali ottenuti tramite endoscopia gastrointestinale superiore per rilevare trofozoiti

Esaminare a fresco, o conservare in formalina o in un altro fissativo.

Esaminare i campioni diretti e concentrati.

Le cisti sono di solito osservate in preparati a fresco e i trofozoiti sono visti su vetrini fissati, colorati in tricromia.

I test per gli antigeni fecali o per il DNA sono più sensibili.

Microsporidia

Campioni multipli di feci raccolte giornalmente o a giorni alterni

Le biopsie dell'intestino tenue possono essere necessarie se i campioni di feci risultano negativi.

I campioni colorati con metodi cromotropici sono quelli più ampiamente usati. Per l'identificazione rapida possono essere utilizzati anche agenti chemofluorescenti come il bianco calcofluoro.

La microscopia elettronica è il metodo più sensibile e viene utilizzata per la differenziazione di specie.

I test per il DNA nelle feci o nei tessuti sono disponibili per alcune specie.

Cestodi (tenie)

Nematodi (ascaridi)

Ascaris

Anchilostoma

Strongyloides

Trichuris

Trematodi (fasciole)

Altri

Campioni multipli di feci raccolti giornalmente (fino a 7 campioni per lo Strongyloides)

Refrigerare il campione ed esaminarlo a fresco, o fissarlo in formalina al 10% e concentrarlo usando la sedimentazione in formalina-etil acetato.

Le larve attive si osservano solo in caso di Strongyloides; le uova sono osservate insieme con altri elminti intestinali.

Se le feci sono mantenute a temperatura ambiente, le uova di anchilostoma possono schiudersi, liberando le larve che devono essere differenziate dalle larve di Strongyloides.

Quando si sospetta Strongyloides e l'esame diretto è negativo, deve essere eseguito ≥ 1 dei seguenti esami specialistici delle feci:

• Concentrazione di formalina-acetato di etile

• Recupero delle larve con la tecnica dell'imbuto di Baermann

• Coltura con il metodo a piastra con filtro di Harada-Mori

• Coltura su piastra di agar

Espettorato o aspirato dal tratto respiratorio

Paragonimus spp

Escreato fresco

Esaminare al più presto il campione o conservarlo per eseguire l'esame successivamente.

Possono essere necessarie tecniche di concentrazione.

Occasionalmente, le uova sono presenti nel liquido pleurico.

Strongyloides spp (infezione massiva)

Espettorato, qualsiasi materiale aspirato, liquido ottenuto da lavaggio broncoalveolare o materiale di drenaggio

Esaminare al più presto il campione o conservarlo per eseguire l'esame successivamente.

Le larve attive possono essere osservate nei preparati a fresco oppure fissate e colorate con Giemsa.

Biopsia polmonare

Paragonimus spp

Biopsia polmonare chirurgica a cielo aperto o percutanea guidata da fluoroscopia o TC

Raccogliere e disporre in contenitore sterile con soluzione fisiologica sterile. Fissare e colorare con Giemsa o ematossilina-eosina.

Possono essere identificati uova e vermi adulti.

Cute

Leishmania spp (Leishmaniosi cutanea)

Biopsia di una zona non ulcerata della lesione e apposizioni o raschiati cutanei

Cercare gli amastigoti nelle apposizioni colorate con Giemsa o negli strisci e nei campioni bioptici colorati con ematossilina e eosina.

Gli amastigoti della Leishmania sono morfologicamente indistinguibili da quelli del Trypanosoma cruzi. La leishmania può essere coltivata con biopsie cutanee, ma la crescita in vitro può richiedere settimane.

Sono disponibili test molecolari per il DNA della leishmania.

Onchocerca volvulus

Per pazienti che hanno contratto l'infezione in Africa: prelievi cutanei (skin snip) dalla coscia, dai glutei o dalla cresta iliaca

Per pazienti che hanno contratto l'infezione in America Latina: prelievi cutanei dalla testa, dalla scapola o dai glutei

Per la biopsia “skin snip”, disinfettare la cute con alcol, inserire un ago da 25 subito sotto l'epidermide, sollevarlo e asportare un piccolo frammento di tessuto con un bisturi o una lama di rasoio, o usare uno strumento da punch biopsy sclero-corneale. Si deve evitare il sanguinamento. Esaminare a fresco o fissare in metanolo e colorare con Giemsa o ematossilina-eosina.

Esaminare il campione sospeso in soluzione fisiologica per la microfilaria mobile che migra dal frammento cutaneo. Le microfilarie possono essere viste nelle sezioni di tessuto.

Secrezioni urogenitali o biopsia

Schistosoma haematobium, a volte S. japonicum

Urine fresche o biopsia della vescica urinaria, in particolare dell'area intorno al trigono vescicale

Il periodo consigliato per la raccolta delle urine è tra le 12:00 e le 15:00. La centrifugazione aumenta la probabilità di rilevamento.

Le uova possono essere osservate in preparati a fresco di urina o in campioni bioptici della vescica.

Trichomonas vaginalis

Tamponi di secrezioni vaginali, cervicali, uretrali o prostatiche collocati in una provetta con una piccola quantità di soluzione fisiologica sterile

Esaminare i preparati a fresco entro 10–15 minuti dalla raccolta del liquido vaginale, poiché i tricomonadi diventano meno mobili nel tempo.

L'identificazione dei microrganismi mobili nel preparato a fresco è il test più rapido ma è meno sensibile. La coltura è più sensibile ma richiede 5–7 giorni e necessita di incubazione.

Sono disponibili anche test di amplificazione degli acidi nucleici altamente sensibili e specifici eseguiti su campioni vaginali, cervicali, uretrali e urinari.