Сбор и обработка образцов для микроскопической диагностики паразитарных инфекций

Кровь

виды рода Plasmodium

Толстый и тонкий мазки капиллярной крови (т.е., из пальца или мочки уха, с использованием одноразового ланцета) или 5–10 мл свежей, предохранённой от свёртывания крови (предпочтительно в пробирках, содержащих ЭДТК)

Взять множественные образцы во время острого заболевания.

Подготовить мазки по капиллярной крови или крови с предотвращением от свёртывания в течение 3 часов после забора крови.

Применять окрашивание по Райту или Гимза.

Убедиться, что предметные стёкла чистые.

Babesia spp

Толстый и тонкий мазки крови, как и на виды Plasmodium

Забор как и на Plasmodium spp

Применять окрашивание по Райту или Гимза.

Морфология похожа на кольцевые формы вида Plasmodium, но без пигмента и гаметоцит. Тетрады характерны для вида Babesia, но необязательны.

Толстые мазки крови могут быть сложны для интерпретации и должны выполняться только опытным микроскопистом. На мазке крови может наблюдаться картина «мальтийского креста».

Ворсинчатые черви

Толстая капля и тонкий мазок из 1 мл крови с антикоагулянтом; если первый образец отрицательный, получают 5-10 мл, концентрируют центрифугированием или фильтрацией

Микрофилярии Wuchereria bancrofti и Brugia malayi: брать кровь следует между 10 часами вечера и 2 часами утра.

Микрофилярии Loa loa, Dipetalonema perstans и Mansonella ozzardi: забор крови проводят с 10:00 до 18:00.

Филярии демонстрируют суточную периодичность, поэтому для оптимизации обнаружения образцы необходимо собирать в определенные периоды времени.

Для окрашивания можно использовать красители Гимзы или гематоксилин-эозин напрямую, но для более высокой чувствительности процедуру проводят после концентрации в 2% растворе формалина (метод Кнотта) или после фильтрации через мембранный фильтр Nucleopore.

Виды Trypanosoma

Тонкие мазки капиллярной крови или 5-6 мл крови с предотвращением свертываемости

Следует провести забор капиллярной или антикоагулированной крови. Мазок на предметном стекле.

Для повышения чувствительности метода используются различные концентрационные методики.

Подвижные трипаносомы видны во влажных препаратах; окрашивание по Гимзе (или по Фильду) используется для идентификации трипаносом в фиксированных препаратах.

Костный мозг, другая ретикулоэндотелиальная ткань или цереброспинальную жидкость

Виды рода Leishmania (висцеральный лейшманиоз)

Аспират костного мозга, селезёнки, печени или лимфоузлов или мазки с лейкоцитной плёнки

Мазок на предметном стекле.

Применяют красители Гимза, Райт-Гимза или окраску гематоксилин-эозином.

Naegleria

Acanthamoeba

Balamuthia

Свежий образец спинномозговой жидкости

Применять методы асептического забора.

Исследовать образцы как можно быстрее.

Исследовать с применением световой или контрастной микроскопии.

Паразиты могут быть идентифицированы по движению; их можно фиксировать и окрашивать по Гимзе или выращивать в питательной среде.

Trypanosoma brucei rhodesiense

Trypanosoma brucei gambiense

Аспират лимфатических узлов или шанкра

Свежий образец спинномозговой жидкости

Применять методы асептического забора.

Для определения подвижных паразитов применяют влажные препараты*, или же образцы фиксируют и окрашивают по Гимзе или по Филду до или после их концентрирования посредством центрифугирования.

Аспират двенадцатиперстной кишки или еюнальная биопсия

виды рода Giardia

Виды Cryptosporidium

Виды Cystoisospora

Виды Cyclospora

Микроспоридии

Виды Strongyloides (кишечной угрицы)

Аспират двенадцатиперстной кишки или биоптат тощей кишки во время эндоскопии

Следует незамедлительно провести исследование аспирата или выполнить его фиксацию и окрашивание.

Необходимо провести гистопатологическое исследование материала биопсии.

Необходимо использовать влажный препарат с аспиратом для диагностики на яйца или личинки паразита Strongyloides. Для диагноза могут использоваться несколько видов окрашивания (подробную информацию смотрите ниже в разделе "Кал").

Основным методом обнаружения и видовой идентификации микроспоридий является трансмиссионная электронная микроскопия.

Ректальная биопсия

Schistosoma mansoni

Schistosoma japonicum

Образцы ректальной биопсии с уровня дорсальной складки (складка Хаустона), примерно 9 см от ануса

Зафиксируйте образец для гистопатологического исследования и раздавите фрагмент между предметными стеклами для повышения чувствительности.

Видообразование основано на морфологии зрелых яйцеклеток.

Ректосигмоидоскопия (проктоскопия)

Entamoeba histolytica

Свежие соскобы с помощью кюретки или ложечки Фолькмана, биопсия слизистой оболочки или аспират из очага поражения, взятый с помощью пипетки объемом 1 мл с резиновой грушей (ватные тампоны не подходят)

Необходимо осмотреть образец сразу же или после фиксации и окрашивания.

Используют влажные или фиксированные окрашенные препараты (например, с трихромным красителем) для обнаружения трофозоитов и цист. Образцы стула анализируют на ДНК или наличие антигена к E. histolytica; эти анализы более чувствительны и могут отличать E. histolytica от E. dispar и других непатогенных амеб.

Стул

Виды Cryptosporidium

Анализ кала на яйца гельминтов и паразитов, выполненный на нескольких свежевыделенных порциях кала, собранных ежедневно или через день

Свежие образцы охлаждают и изучают или хранят в формалине или другом фиксаторе.

Обращаться аккуратно, свежий кал и тот, который хранится в дихромате – заразный.

Для диагностики могут использоваться биопсия или аспират двенадцатиперстной кишки.

Влажные препараты необходимо изучать под обычным светом, дифференциальным интерференционным контрастом и иммунофлуоресцентной микроскопией.

Окрашивание образцов модифицированным методом по Цилю-Нильсену или с помощью модифицированного метода окрашивания сафранином.

Анализ на фекальные антигены или ДНК более чувствительные.

Виды Cyclospora

Анализ кала на яйца гельминтов и паразитов, выполненный на нескольких свежевыделенных порциях кала, собранных ежедневно или через день

Образцы следует охладить и изучить в свежем или замороженном виде или зафиксировать в 10%-ом формалине и 2,5%-ом дихромате калия. Разные лабораторные анализы требуют разных методов сохранения материала. Методы концентрации увеличивают чувствительность диагностики.

Исследовать влажные препараты обычным светом, дифференциальным интерференционным контрастом яркого поля и микроскопией в УФ-свете. Ооцисты аутофлуоресцентны при ультрафиолетовом свете. Фиксированные образцы могут быть окрашены модифицированным методом по Цилю-Нильсену или модифицированным методом окрашивания сафранином.

Анализ споруляции может отличить представителей Cyclospora от сине-зеленых водорослей.

Анализы на ДНК в кале являются специфичными и более чувствительными.

Виды Cystoisospora

Анализ кала на яйца гельминтов и паразитов, выполненный на нескольких свежевыделенных порциях кала, собранных ежедневно или через день

Свежевзятый материал изучают или хранят его в формалине или другом фиксаторе. Методы концентрации увеличивают чувствительность.

Ооцисты могут быть визуализированы во влажном препарате дифференциальным интерференционным контрастом яркого поля или эпифлуоресцентной микроскопией.

Окрашивать зафиксированные образцы модифицированным кислотостойким красителем.

Если результат анализа кала отрицательный, то диагностику можно осуществить с помощью аспирата из двенадцатиперстной кишки или образцов биопсии.

Entamoeba dispar

Entamoeba histolytica

Другие амебы

Соберите несколько свежих образцов стула утром.

Исследуйте несформированные или диарейные образцы в течение 15 минут.

Держите сформированные образцы в холодильнике до исследования. Храните образцы в формалине или другом фиксаторе.

Используйте влажные препараты и фиксированные окрашенные препараты (например, трихромным красителем), а также методы концентрации для обнаружения цист.

Кал следует исследовать на ДНК или наличие специфического антигена E. histolytica, этот анализ является более чувствительным и способен отличить E. histolytica от E. dispar и других непатогенных амеб.

Enterobius spp

Яйца глистов, собранные с области вокруг ануса на липкую ленту и помещенные на предметное стекло

Рутинное исследование кала на яйца и паразиты из множественных свежих образцов, собираемых ежедневно или через день

Берите образец в области вокруг ануса утром перед туалетом или принятием ванны.

Яйца Enterobius иногда могут быть обнаружены в образце кала или влагалищном/цервикальном мазке (например, как случайная находка при Пап-тесте).

Взрослые черви могут быть обнаружены при осмотре перианальной области или влагалища.

виды рода Giardia

Несколько образцов свежего стула (≥ 3) берут утром через день

Дуоденальные аспираты, полученные с помощью верхней гастроинтестинальной эндоскопии, для выявления трофозоитов

Свежевзятый материал изучают или хранят его в формалине или другом фиксаторе.

Следует исследовать прямые и концентрированные образцы.

Цисты обычно обнаруживаются во влажных препаратах, а трофозоиты – в фиксированных препаратах, окрашенных трихромом.

Анализ на фекальные антигены или ДНК более чувствительные.

Микроспоридии

Множественные образцы свежего кала, собираемые ежедневно или через день

Может потребоваться биопсия тонкой кишки, если результат по калу отрицательный.

Обычно используются образцы, окрашенные хромотропным методом. Хемофлуоресцентные вещества, такие как калькофлуор, также могут применяться для быстрой идентификации.

Электронная микроскопия – наиболее чувствительный метод.

Анализы на ДНК в кале или ткани доступны для некоторых видов паразитарных червей.

Цестоды (ленточные черви)

Нематоды (круглые черви)

Ascaris

Нематоды

Strongyloides

Trichuris

Трематоды (сосальщики)

Другие

Ежедневный многократный забор образцов кала (не менее 7 образцов для обнаружения Strongyloides)

Образец охлаждают и изучают в свежем виде или фиксируют в 10%-ом формалине и концентрируют посредством осаждения в формалин-этил-ацетате.

Активные личинки выявляют у Strongyloides; выявление яиц возможно и в случае других кишечных гельминтов.

Если образцы стула хранятся при температуре окружающей среды, из яиц нематод могут вылупляться личинки, которые должны быть дифференцированы от личинок Strongyloides.

При подозрении на Strongyloides и отрицательном прямом осмотре необходимо провести ≥ 1 из следующих специализированных анализов кала:

• Концентрация формалина-этилацетата

• Выявление личинок методом воронки Baermann

• Культивирование методом фильтрующей пластинки Harada-Mori

• Культура на агаровой пластинке

Мокрота или аспират респираторного тракта

виды рода Paragonimus

Свежая мокрота

Исследовать образец как можно раньше или законсервировать и хранить до более позднего исследования.

Могут понадобиться методы концентрации.

Иногда яйца паразитов можно обнаружить в плевральной жидкости.

Strongyloides spp (гиперинфекция)

Мокрота, любой аспирируемый материал, жидкость, полученная при БАЛ, или дренажный материал

Исследовать образец как можно раньше или зафиксировать и держать до более позднего исследования.

Активные яйцеклетки можно увидеть во влажном препарате или их можно зафиксировать и окрашивать по Гимза.

Биопсия легких

виды рода Paragonimus

Открытая или перкутанная биопсия легкого, проводимая под контролем флуороскопии или КТ

Собранные образцы помещают в стерильный контейнер со стерильным соляным раствором. Фиксируют и окрашивают красителем Гимзы или гематоксилин-эозином.

Могут быть обнаружены яйца и взрослые трематоды.

Кожа

Leishmania spp Кожный лейшманиоз

Биопсия пораженного участка без признаков изъязвления и мазок-отпечаток или соскоб

Мазки-отпечатки, окрашенные по Гимзе, или соскобы и образцы биопсии, окрашенные гематоксилин-эозином, исследуют на предмет амастигот.

Амастиготы Leishmania морфологически неотличимы от амастигот Trypanosoma cruzi. Паразитов Leishmania можно культивировать из образцов кожи, взятых с помощью биопсии, однако их выращивание in vitro может занять несколько недель.

Доступны молекулярные анализы на ДНК лейшмании.

Onchocerca volvulus

Для пациентов, заражённых в Африке: образцы кожи с бедра, ягодиц или подвздошного гребня

Для пациентов, инфицированных в Латинской Америке: образцы кожи с головы, лопатки или ягодиц

Для взятия образца, обработать место спиртом, ввести иглу №25 прямо под эпидермис, приподнять его и отделить маленький кусочек ткани скальпелем или бритвой или использовать в качестве инструмента склерокорнеальный перфоратор для биопсии. Кровотечения быть не должно. Изучают свежий материал или фиксируют его в метаноле и окрашивают красителем Гимзы или гематоксилин-эозином.

Образец, суспензированный в физиологическом растворе, исследуют на наличие подвижных микрофилярий, мигрировавших с образца кожи. Микрофилярии можно обнаружить на срезах тканей.

Секреты мочеполовой системы или биопсия

Schistosoma haematobium, иногда S. japonicum

Свежая моча или биопсия мочевого пузыря, в частности, области вокруг треугольника

Рекомендуемое время для сбора мочи – между 12 и 3 часами дня. Центрифугирование повышает вероятность обнаружения.

Яйца можно обнаружить во влажных препаратах с образцами мочи или в биопсийном материале из мочевого пузыря.

Trichomonas vaginalis

Мазки из влагалища, шейки матки, уретры или предстательной железы помещают в пробирку с небольшим объёмом стерильного физиологического раствора

Препараты для микроскопии во влажном состоянии следует исследовать в течение 10–15 минут после взятия вагинального секрета, поскольку подвижность трихомонад со временем снижается.

Выявление подвижных организмов на влажном препарате – самый быстрый тест, но менее чувствительный. Культуральный метод более чувствителен, но занимает 5–7 дней и требует инкубации.

Также доступны высокочувствительные и высокоспецифичные тесты амплификации нуклеиновых кислот, выполняемые на образцах влагалищного, цервикального, уретрального секрета, а также мочи.