O líquido cefalorraquidiano flui por um canal (espaço subaracnóideo) entre as camadas de tecido (meninges) média e interna que revestem o cérebro e a medula espinhal. Para coletar uma amostra desse líquido, o médico insere uma agulha pequena e oca entre dois ossos (vértebras) na parte inferior da coluna vertebral, geralmente entre a 3ª e a 4ª ou a 4ª e a 5ª vértebras lombares, abaixo do ponto em que a medula espinhal termina e, então, entra no espaço subaracnóideo – o espaço entre as camadas de tecido (meninges) que cobrem a medula espinhal (e o cérebro). Em geral, o indivíduo deita-se de lado, com os joelhos dobrados tocando o peito. Essa posição amplia o espaço entre as vértebras, e com isso o médico consegue evitar tocar nos ossos ao inserir a agulha.

O líquido cefalorraquidiano, então, pinga, gota a gota, em tubos de ensaio e as amostras são enviadas para um laboratório, para análise.